关于多根乌头消炎止痛活性的研究与从三种乌头植物中提炼物和指标性分子的抗癌活性分析

1 三种乌头提取物制备

1.1 实验材料
1.1.1 药材
准噶尔乌头(Aconitum soongoricum Stapf.)采自那拉提，多根乌头(Aconitumkarakolicum Rapaics)采自昭苏，白喉乌头(Aconitum leucostomum Worosch)采自巩留（经新疆医科大学中药系主任张帆教授鉴定），凭证标本保存于新疆医科大学中药民族药标本馆。
1.1.2 试剂
环己烷（天津富宇精细化工有限公司，批号：120507）；乙酸乙酯（天津富宇精细化工有限公司，批号：120915）；无水乙醇（天津富宇精细化工有限公司，批号：120924）；以上试剂均为分析纯。
1.1.3 主要仪器
AL204 型万分之一电子天平(梅特勒-托利多公司)；B-260 型水浴锅(上海亚荣生化仪器厂)；SHB-111 型真空泵(郑州长城科技工贸有限公司)；RE52cs-2 型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；DZF-6012 型真空干燥箱(上海市精宏实验设备有限公司)；TDL-40B 型台式低速离心机(上海安亭科学仪器厂)；KQ-40ODB 型超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)。
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1.2 实验方法
1.2.1 乌头前处理
将采集到的乌头样品仔细挑出，除去混杂的在草和尘土，用剪刀减掉多余的根茎，把附着在乌头根部及中空芯内的土块灰尘用小刷子以及拨针仔细剔除干净，粉碎，过 20 目筛备用。
1.2.2 实验步骤
a.将乌头粉末用 2 倍体积蒸馏水浸泡 4 小时[22~23]，75 ℃水浴热浸，每 15 分钟进行一次搅拌，水浴 12 小时后，静置沉淀，倒出上层清液，下层浑浊浸液与乌头残渣用纱布过滤，挤净乌头残渣中残留的液体得到初滤液，初滤液用离心机 5000 r/min离心 10 分钟，离心沉淀与乌头残渣混合，放入干燥箱中干燥备用；上清液与之前倒出的水液合并用布氏漏斗抽滤，所得滤液用旋转蒸发仪浓缩得到浓浸膏，最后将浓浸膏放入减压干燥箱中，50 ℃恒温干燥得到固体为水提取物。
b.将蒸馏水提取过的干燥乌头残渣用 2 倍体积环己烷室温浸泡，每 15 分钟进行一次搅拌，浸泡 10 小时后，静置沉淀，倒出上层上清液，下层浑浊浸液与乌头残渣用纱布过滤，挤净乌头残渣中残留的液体，将乌头残渣放入干燥箱中干燥备用；所得液体合并用布氏漏斗抽滤得到滤液，用旋转蒸发仪将滤液浓缩成浓浸膏，最后将浓浸膏放入减压干燥箱中，50 ℃恒温干燥得到油状粘稠膏体为环己烷提取物。
c. 将环己烷提取过的干燥乌头残渣用 2 倍体积乙酸乙酯室温浸泡用 4 小时，再回流加热 10 小时，静置沉淀，倒出上层上清液，下层浑浊浸液方法同 b，50 ℃恒温干燥得到固体为乙酸乙酯提取物。
d. 将乙酸乙酯提取过的干燥乌头残渣用 2 倍体积 90%乙醇室温浸泡用 4 小时[24]，再回流加热 10 小时，静置沉淀，倒出上层清液，下层浑浊浸液处理方法同 a，50 ℃恒温干燥得到 90%乙醇提取物。（实验操作流程详见图 1。）
实验共得到三种乌头不同提取部位供试品共 12 种，预进行体外抗肿瘤活性筛选实验。
1.2.3 提取方法流程
见图 1。
1.3 实验结果
按照 1.2 中的方法处理实验药材，记录原药材重量和各部位浸膏的重量，得到相关实验数据，详见表 1。

根据原药材和各部位浸膏的重量，可以计算得到出膏率数据，整理并记录相关数据，详见表 2。

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2 体外抗癌实验

2.1 实验材料
2.1.1 细胞系

2.1.2 供试品
乌头提取物 1~23 号，微溶于水，由新疆医科大学提供，保存于密闭置阴凉处。记录编号和供试品名称对应情况，详见表 4。

2.1.3 阳性对照品
注射用顺铂（DDP），由齐鲁制药有限公司生产（批号：1100331DB；10 mg/瓶）。
2.1.4 主要试剂
高糖 DMEM 培养基（批号 NXJ0709，500 mL/瓶），改良型-1640 完全培养基（批号 NYK1006，500 mL/瓶），胎牛血清（批号 NXC0582，500 mL/瓶），均购于 HyClone公司；噻唑蓝（批号 MKBH7489V，1 g/瓶）购于 sigma 公司；二甲亚砜（国药集团化学试剂有限公司，批号 20120705，500 mL/瓶）；胰蛋白酶（北京鼎国昌盛生物技术有限公司，批号 04D10151，25 g/瓶）。
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2.2 试验方法
2.2.1 试剂配制
根据细胞的种类不同，需要配制两种培养基[25~26]，分别是含 10%胎牛血清和 1%双抗的高糖DMEM完全培养基和含10%胎牛血清和1%双抗的改良型-1640完全培养基，其中，加入的双抗是 10000 U/mL，在培养基中的终浓度为 100 U/mL。
胰蛋白酶的配制：精密称取胰蛋白酶粉 2.5 g，EDTA 0.4 g，用 1000 mL 生理盐水搅拌溶解，配制成浓度为 0.25 %的 EDTA 胰蛋白酶溶液[27]，室温下静置过夜，溶液在无菌条件下过 0.22 μm 滤膜除菌分装，存放于-4 ℃冰箱，备用。
冻存液的配制：无血清培养基 60 %，胎牛血清 30 %，DMSO 10 %混合均匀，现用现配。
MTT 溶液配制：用生理盐水溶解 1 g MTT 固体粉末，精确定容至 200 mL，配制成 5 mg/mL 的工作液，在无菌条件下过 0.22 μm 滤膜除菌分装，整个过程尽量避光操作，溶液避光存放于- 4 ℃冰箱，备用。
PBS 缓冲液的配制：按照湖南省药物安全评价研究中心相关 SOPs 规定，精密称取混合缓冲盐，精确定容至 1000 mL，详细配置方法见表 5。

将定容配制好的 PBS 缓冲液缓冲液装瓶，放入高压灭菌锅中 105 ℃高温灭菌 30分钟，以保证溶液的无菌卫生，室温存放备用。
阳性药的配制及剂量设计：根据预实验结果，称取一定量 DDP，用无血清培养基定容配制成浓度 50 μg/mL 的最高浓度药液，剂量号为⑴，取⑴号溶液 0.3 mL 定容至 1 mL 为⑵，取⑴号溶液 0.1 mL 定容至 1 mL 为⑶，取⑵号溶液 0.1 mL 定容至 1mL 为⑷，取⑶号溶液 0.1 mL 定容至 1 mL 为⑸，取⑷号溶液 0.1 mL 定容至 1 mL 为⑹，记录剂量分组数据，详见表 6。

供试品的母液配制：分别称取 1、3、4、5、7、8、9、11、12 号固体供试品，用 DMSO 将供试品溶解配制为 500 mg/mL 的母液备用；分别量取一定量的 2、6、10号液体供试品，用 DMSO 将供试品溶解配制为 1000 μL/mL 的母液备用；分别称取一定量的 13~23 号指标性成分供试品，用 DMSO 将供试品溶解配制为 100 mg/mL 的母液备用。
根据预实验结果确定分组剂量：供试品配制时，量取 3 μL 母液，根据实验细胞需要，选用相应的无血清培养基将母液定容至 1.5 mL，配制成最高浓度工作液⑴，在无菌条件下工作液过 0.22 μm 滤膜除菌后备用，稀释配制步骤参照阳性药，记录剂量分组数据，详见表 7~9。
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3. 多根乌头急性毒性实验………………………21
3.1 实验材料……………………… 21
3.2 实验方法……………………… 22
3.3 实验结果……………………… 25
4. 多根乌头抗炎实验··……………………… 26
4.1 实验材料………………………… 26
4.2 实验方法……………………………… 27
4.3 实验结果…………………………… 28

5 多根乌头不同部位提取物对醋酸致小鼠扭体的影响

5.1 实验材料
5.1.1 供试品
同3.1.1。
5.1.2 实验动物
SPF级ICR小鼠，50只，雄性，体重范围：17.2~21.8 g，平均体重：19.9 g[38]，于湖南省药物安全评价研究中心SPF级环境饲养。
5.1.3 主要试剂
冰醋酸 批号：T20090312；国药集团化学试剂有限公司。
0.6% 冰醋酸溶液：取0.3 mL冰醋酸溶液到50 mL容量瓶中，用0.9 %氯化钠注射液定容至50 mL，现配现用。

5.2 实验方法
5.2.1 实验分组
ICR 小鼠，50 只，雄性，按体重随机分为 5 组，每组 10 只，即阴性对照组、水提取物组、环己烷提取物组、乙酸乙酯提取物组及 90 %乙醇提取物组，除阴性对照组灌胃给予等量的注射用生理盐水外，其余各组分别灌胃给予药液，每天 1 次，连续给药 7 天[39]。
5.2.2 操作方法
末次给药后 45 分钟，各组小鼠腹腔注射 0.6%冰醋酸溶液 0.2mL/10g，连续观察15 分钟，并观察记录每只小鼠的扭体反应和次数。
5.2.3 检测指标
观察记录每只小鼠的扭体反应（腹部内凹，伸展后肢，臀部抬高）次数，统计15 分钟小鼠扭体次数。
5.2.4 剂量设计
供试品根据小鼠急性毒性实验拟定实验给药剂量，实验供试品为药材浸膏，水提取物含量为 4 g 生药/g 浸膏、环己烷提取物含量为 260.84 g 生药/g 浸膏、乙酸乙酯提取物含量为 115.31 g 生药/g 浸膏及 90%乙醇提取物含量为 0.58 g 生药/g 浸膏，小鼠体重按 20 g 计，试品用生理盐水溶解。
小鼠给药剂量用等效剂量推算，具体见表 24。

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小 结

本课题首次对准噶尔乌头(Aconitum soongoricum Stapf.)、多根乌头(Aconitumkarakolicum Rapaics)、白喉乌头(Aconitum leucostomum Worosch) 三种新疆地产乌头属植物提取物对抑制肿瘤细胞的生长情况以及多根乌头急毒和药效学进行研究，实验结果总结如下：
1. 多根乌头浸出物出膏率为 47.18%，准噶尔乌头的出膏率为 45.94%，白喉乌头的出膏率为 35.66%。
2. 三种新疆地产乌头植物中，白喉乌头对肿瘤细胞的生长抑制效果最好；各个提取组分中环己烷提取物对肿瘤细胞生长的抑制效果最好；指标性成分中，12-epi-napelline 对肿瘤细胞生长的抑制效果最好。
3. 多根乌头急性毒性实验确定多根乌头水提取物组的毒性最大，约为人体剂量的 1.4 倍；其次为 90%乙醇提取物组，约为人体剂量的 5 倍；再次为乙酸乙酯提取物组，约为人体剂量的 15 倍；环己烷提取物组的毒性最小约为人体剂量的 56 倍。
4. 多根乌头抗炎实验中，乙酸乙酯提取物对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的抑制最明显，抑制率为 32.75%，初步判断多根乌头抗炎有效部位为乙酸乙酯部位。
5. 多根乌头镇痛实验中，乙酸乙酯提取物组对醋酸致小鼠扭体抑制作用最明显，抑制率为 61.38%，初步判断多根乌头镇痛有效部位为乙酸乙酯部位。
本课题通过实验对三种新疆地产乌头药材的活性部位作出基本判断，初步评价新疆地产乌头药效。为开发新疆地产乌头药材资源，进一步研究其药效机理实验提供实验依据。
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参考文献（略）