人参内生细菌gel5抑菌机理及病害防治效果评价分析

第一章文献综述

1人参概述
人参(Panax gimmg C. A. Meyer)是五加科(Araliaceae)人参属药用植物，目前主要分布在中国的长白山区、朝鲜半岛和俄罗斯远东地区[1]。我国现存最早的药物学专著《神农百草经》对人参的药用价值有详细的论述，人参能强身益智，明目，安精神，止惊淨，久服后延年益寿，因其具有神奇而广泛的作用，故享有“百草之王”的美誉[2]。目前，人参的种植主要依赖人工栽培，栽培模式分为园参栽培、林下参栽培和非林地栽培3种[3.5]，其栽培技术基本相同，都是以野生人参的生长环境和习性为切入点，根据园地、林下和非林地的实际环境特点调整技术来种植16]。
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2人参病害及其危害
人参由野生变人工栽培后，病害逐年加重，导致人参产量及品质降低，成为困扰人参产业发展的突出问题。据国内外报道，在人参上发生的侵染性和非侵染性病害有50余种，中国已经报道的有30余种。在20世纪50年代中后期至今40余年中，对人参病害的发生分布为害的调查、病原种类、发生规律及预测预报、综合防治等研究，从理论到实践均取得了明显的进展，在生产防治中发挥了积极作用，使我国人参病害防治研究处于世界先进行列。
土传病害是人参侵染性病害的一种主要方式。引起人参土传病害的病原菌种类较多，国内外有记述的主要有锈腐菌(Cylindrocarpon destructans)、疫病菌(Phytophthora cactomm)、根腐菌(Fusarium TO/am’)、黑斑菌(Altemariapanax)、菌核菌(Seclerotiniapanax)、立枯丝核菌(Mhizoctonia solani)等岡。上述病原菌多以土壤为媒介进行繁殖和传播，不同地区的栽培管理方式及土壤环境会导致土传病原菌的优势菌群有所差异。
土传病原菌一般从植株的根部或莲基部侵染作物从而引发病害。人参的根部病害有锈腐病、菌核病、疫病、根腐病、黑腐病、黑干腐病、灰霉病、细菌性烂根病等，莲部病害主要有立枯病、猝倒病、枯萎病和黑斑病等，叶部病害主要有黑斑病、疫病、炭疽病、白粉病、诱病等，果实和种子病害主要有黑斑病和白粉病[9]。
其中为害比较严重的病害主要有以下几种：
①人参锈腐病
目前已报道的引起锈腐病的病原菌有5种：诱腐柱孢菌(Cylindrocarpondestructans (Zinns.) Scholton)、拟参柱孢菌Cylindrocarpon morspanacis (Hild.)、人参生柱孢菌(Cylindrocarpon panacicola (Zinns.) Zhao et Zhu)、粗壮柱抱菌(Cylindrocarpon robusta Hild.)和人参柱孢菌Cylindrocarpon panacis Matuo etMiyazawa)。绣腐病菌能侵染各年生的参根、莲和芽孢等部位，发病初期参根表皮出现黄锈色小斑点，由浅入深，逐渐扩大汇合，最后病斑呈近圆形、椭圆形或不规则形，呈锈色，边缘稍隆起，中央略凹陷，与健康部位界限明显。绣腐病发生普遍，为人参根部主要病害，从早春到晚秋整个生育期均能侵染，各年生参根均有发生，发病率为30%?40%，严重地块发病率可高达70%以上。参根染病造成严重减产，严重降低人参产量、品质，给人参产业生产造成重大经济损失。
②人参立枯病
立枯病病原菌为立枯丝核菌(Rhizoctonia solanD)主要发病部位在地表下幼苗莲基部，距土表3~5 cm的干湿土交界处，莲基发病部位初呈黄褐色小斑点，后扩大呈H陷长斑，逐渐深入莲内，使病莲溢缩变细软化，致使人参莲叶萎蔫，成片死亩。该病发生普遍，分布广泛，是参苗期的主要病害之一，主要侵染1~2年小苗，一般植株被害率在20%以上，严重地块可达50%，造成参苗成片死亡，损失较大。
③人参碎倒病
猝倒病的病原菌为德巴利腐霉菌CPythium debaryanum Hesse),主要为害二年生以内的人参幼苗，从近地面处幼莲基部开始侵染参苗，发病部位萎缩变软，直至全株倒伏死亡。该病是人参苗期常见的多发病之一，严重时可致参苗成片死亡。
④人参黑斑病
黑斑病病原菌为人参链格孢菌panojc Whetz.),以为害叶片为主，也可为害莲、花梗、果实等，该病对人参地上部分为害最严重，发生最普遍，损失较大的病害之一。发病率在20%~30%，严重时可达80%以上，国内人参栽培无不被黑斑病困扰。当降雨量和空气湿度适宜时，黑斑病发病迅速，可在很短时间大面积流行。黑斑病侵染叶、茎部时造成早期落叶，致使参籽、参根产量低品质差，侵染花梗、果实时造成花序枯死，果实与籽粒干瘪，严重时造成种子绝收。
⑤人参疫病
疫病病原菌为恶疫霉菌(Phytophthora cactorum (Lib. et Coh.) Schroet.)，菌丝体白色，棉絮状，主要为害叶片、叶柄、莲和参根，被害植株初在嫩莲或叶柄上生褐色、水浸状、无边缘的病斑，在整个生育期内均有发生，温度和湿度是影响疫病发生的主要因素。该病是人参成株期的严重病害之一，又称湿腐病。在我国人参主产区普遍发生，植株被害率一般在10%~20%，严重的可达50%以上，流行时损失重大。
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第二章人参内生细菌的分离鉴定及拮抗菌株的筛选

人参作为重要的药用植物，其病害是影响人参产量及品质的关键因素之一。传统的方法主要是通过化学农药和田间管理进行防治，化学农药尽管防治效果显著，但是病原菌的耐药性、环境污染等问题也很难解决。目前，生物防治成为一个研究防治药用植物病害的热点，藤艳萍[63]通过研究木霉对黄蔑根腐病原菌的拮抗作用及盆栽防治黄苗根腐病的情况，发现3种木霉制剂均有抑制黄蔑根腐病的显著效果，但是一些生防菌如木霉菌易受外界环境因素干扰，对植物病害的防效不稳定。内生细菌生活于植物体内，生存环境相对稳定，如能从中发现生防菌株，将有助于解决现有生防菌病害防效不稳定的问题。迄今，国内已有许多关于人参内生细菌的研究报道，邱服斌等[24]对人参内生细菌进行分离鉴定，姜竹[25]从人参根部分离出内生细菌，并研究其抑菌物质。本章从新鲜健康的人参根内分离纯化出内生细菌，并通过对峙培养观察不同内生细菌对人参病原菌生长的影响，蹄选出对人参病原菌具有拮抗作用的内生细菌，并用l6SrDNA和形态观察等方法进行鉴定，确定拮抗内生细菌的种属。

1试验材料
1.1供试材料
供试植物材料为釆自吉林省抚松县人参生产基地的健康人参。供试人参病原菌包括人参锈腐菌Cyli/tdrocarpon destructans、人参疫病菌Phytophthoracactorum、人参黑斑菌Atermrrfapanax，由课题组保存。
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2试验方法
2.1内生细菌的鉴定
2.1.1分子鉴定
通过分子鉴定的方法确定细菌归属。其16S rDNA序列分析：取适量细菌至无菌水中，充分震荡成细菌悬独液，进行细菌单菌落的16SrDNA的PCR扩增。引物 fDl(5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’)和 rPl( 5’-ACG GTT ACCTTGTTACGACTT-3')扩增细菌 16S rDNA。扩增体系为 25 包括 lOxPCRBuffer (lOOmmol.L-iTris，500 mmol L-1 KCL 20 mmol-L-1 Mg-1, pH8.3) 2.5 il，Taq DNA 聚合酶（2.5 ）1 nl，引物（2 ）各 1 nl，dNTP (2.5 mmol-L-1)1 模板DNA (菌悬液)1 l，剩余用重蒸水补足。扩增程序为：94。C 5min；94°C Imin, 55°C 1 min, 72V 1 min, 30 个循环；最后，72°C延伸 lOmin。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，扩增产物测序结果与NCBI细菌数据库进行同源性比较,将比对的结果构建系统发育树，进一步确定同源细菌。
2.1.2形态观察
1)菌落形态
在纯化培养出现单菌落时，注意观察其菌落形态特征，包括其形状、大小、边缘、表面、隆起形状、透明度、湿润或干燥、光滑或粗糖、菌落及培养基的颜色等。
2)革兰氏染色
将在LB培养基中生长8~12 h拮抗菌涂片固定，先用结晶紫初染1 min，水洗，碘液处理Imin，水洗，95%的乙醇脱色30 s，水洗，番红复染Imin，水洗，镜检。阳性反应的细菌染成紫色，阴性反应的染成红色。
3)芽孢染色
采用孔雀绿染色法，挑取抬抗菌涂片后，用饱和孔雀绿水溶液染10 min，用自来水冲洗；再用碱性品红液复染30 S；水洗，吸干；镜检。芽孢呈绿色，菌体和芽孢囊呈微红色。
4)鞭毛染色
在载玻片上滴一滴蒸馏水，取细菌菌苔涂抹于蒸馆水中，将载玻片倾斜使菌液至另一端，平放干燥。甲液染色lOmin，蒸馆水冲洗，乙液冲洗，乙液染色30?60s，加热，冷却后用蒸馆水冲洗，镜检。菌体为深褐色，鞭毛为褐色[67]。
5)电子显微镜观察
收集内生细菌菌液10ml, 5000 rmin'离心2min弃上清。在10 ml的PBS缓冲液中重悬细胞，离心，将细胞重悬在1ml 2.5%的戊二酸中，4°C放置过夜，离心弃上清。用1 ml PBS缓冲液冲液洗漆细胞沉淀3次，离心前室温振荡15min,弃上清。再分别用1ml50%、60%、70%、80%、90%和100%的乙醇洗漆细胞沉淀，离心前室温放置10min。用1ml叔丁醇洗漆细胞，静置过夜，将细胞均匀涂于载玻片上，超速真空冷冻挥干叔丁醇，喷金观察[68]。
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第三章内生细菌gel5抑菌机理研究.................................. 24
1 1试验材料.................................. 24
1.1供试材料.................................. 24
1.2 培养基.................................. 24
1.3主要仪器及试剂.................................. 25
2试验方法.................................. 25
2.1拮抗菌株对人参病原菌生长的影响.................................. 25
2.2拮抗菌株抑菌活性检测.................................. 26
2.3数据分析.................................. 27
3结果与分析.................................. 28
3.1拮抗菌株对人参病原菌生长的影响.................................. 28
3.2 gel5菌株提取物的抑菌活性.................................. 30
4 讨论.................................. 33
第四章内生细菌gel5在人参体内和根区土壤的消长动态研究........................ 35
1试验材料.................................. 35
1.1供试材料.................................. 35
1.2培养基.................................. 35
1.3主要仪器及试剂.................................. 36
2试验方法.................................. 36
2.1菌株标记.................................. 36
2.2菌株消长动态测定.................................. 37
2.3数据分析.................................. 37
3结果与分析.................................. 37
3.1内生菌株gel5的抗生素菌株标记.................................. 37
3.2内生菌在人参体内的消长动态.................................. 38
3.3内生菌株在根区土壤的消长动态.................................. 39
3.4回收菌株的抑菌活性.................................. 39
4 讨论.................................. 40

第五章内生细菌gel5的田间防效试验

人参属药用植物具有多年生（一般5~6年收获）的生长习性，即使用新林地土栽种，生长后期仍会出现植株长势减弱，产量、品质及抗病能力降低等问题。目前，针对人参病害所研究的一些生防菌由于易受外界条件影响，且在与土壤、植物根际细菌微生物的竞争中难以长期占优势，使它们的实用价值受到极大影响。而植物内生细菌因其本身就存在于植株体内，容易占据有利的生态位，能经受住植物自身的防卫反应，并与病原菌直接相互作用，比措抗菌受环境影响小，相对而言生防效果更稳定前期工作表明，内生抬抗菌gel5对人参病原菌的孢子和菌丝生长有一定的抑制作用。世界上对于内生细菌的研究大多集中在实验室蹄选、抑菌机理的研究阶段，对于内生细菌作为生防菌的田间防效的研究较少，还没能真正幵发出在田间应用的生防制剂。而对于生防菌的田间防效研究，Thangave等[121]从土壤中分离到一株哈茨木霉CTrichodermaharzianum),通过离体与田间试验测得该菌对香蕉枯萎病的防效优于多菌灵。本章通过田间试验，研究内生抬抗菌对人参种子出苗和人参参苗存苗的影响，通过对出苗率和存苗率的计算，考察内生菌作为生防菌在田间的防病效果。
1试验材料
1.1供试材料
人参内生细菌gel5菌株均由本课题组分离、保存，人参种子、种苗（二年生）购自吉林省抚松县人参生产基地。
1.2培养基
LB液体培养基：蛋白胨10.0 g，NaCllO.Og，蒸懷水1 L，pH7.0。
LB固体培养基：蛋白胨10.0g，NaCllO.Og，琼脂粉15.0g，蒸溜水1 L，pH7.0。
1.3主要仪器及试剂
恒温培养振荡器（ZHWY-100H,上海智城分析仪器有限公司）
电热恒温培养箱（DH6000，Taisite）
超净工作台（SW-CJ-ID，苏州净化）
立式自动电热压力蒸汽灭菌锅（LX-B5L型，合肥华泰医疗有限公司）
50%多菌灵可湿性粉剂（代理商：新万特农药有限公司）

2实验方法
2.1菌悬液的制备
从培养了 24?48 h的LB培养基上挑取一环gel5菌株接入100 ml LB液体培养基中，3(rC，150 rmin-i振荡培养24 h。取菌株发酵液用分光光度计测量ODsoo.根据标准曲线推算菌液浓度，再将发酵液稀释成108cfirmri的菌悬液，备用。
2.2田间试验
2.2.1田间设计
试验地点位于北京药用植物研究所试验地南区人参荫棚。试验用土为吉林抚松人参种植基地的老参土和新林土。试验从2013年5月1日持续至7月10日。
先将人参幼苗和种子分别在108 的菌悬液中浸泡30 min,取出后分别播种或移栽至装有老参土和新林土的花盆中。人参种子用于出苗率试验，播种于￠15 cm花盆中，每盆播种10粒种子。人参幼苗用于存苗率试验，移栽于0)25 cm花盆中，每盆栽10株幼苗。另一处理组用50%多菌灵300~400倍稀释液浸泡人参种子和幼苗。每个处理栽种10盆，所有花盆置于荫棚中培养，统一进行田间管理，对照组用清水浸泡人参种子和参苗。
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总结

本研究以从人参体内分离出来的内生拮抗细菌为研究对象，在内生细菌的分离，拮抗细菌的筛选、鉴定的基础上，研究其抑菌机理和田间的防效评价，具体结论如下：
1.从二年生的人参体内分离得到40株内生细菌，通过对峙培养筛选出对人参病原菌具有拮抗作用的拮抗菌株gel5，经16S rDNA同源性分析和显微观察，初步鉴定gel5属于窄食单胞菌属。经过NCBI多序列比对和系统发育树的构建，并且对其进行生理生化测定，发现gel5与嗜根寡养单胞菌(Stmotrophomonasrhizophila)的同源性最高（97%同源性），极有可能是一个潜在新种。
2.拮抗菌株gel5与人参病原菌进行对峙试验，有明显的抑菌圈，并且较对照组抑菌效果显著。将对峙培养的病原菌显微观察，发现病原菌菌丝扭曲生长，菌丝表面凹凸不平，有瘤状突起；病原菌的产孢量明显下降，不能正常萌发。gel5菌株发酵液上清液对病原菌有明显抑制作用，对上清液活性物质进行粗提取，发现蛋白粗提取物、脂肽粗提物以及有机溶剂提取的小分子代谢物均具有不同程度的拮抗效果，说明gel5胞外分泌液中的抑菌活性成分并不单一，可能是多种活性物质协同起抗菌作用。
3.用抗生素标记拮抗菌株浇灌人参幼苗，研究gel5在人参体内和根区土壤中的消长动态，结果说明其能在人参体内和根区土壤中定殖一段时间。对回收的标记菌株与病原菌进行对峙培养，发现其仍然具有抑菌效果，说明拮抗菌株gel5抑菌作用稳定。
4.田间病害防效试验结果表明，与对照相比，拮抗菌株gel5和多菌灵对人参病害的防治效果相当，但是gel5若作为生防菌在田间施用，具有无毒、无污染等优点，是一株具有良好应用潜力的生防细菌。
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参考文献（略）