基于P-糖蛋白调控的远志-石菖蒲配伍“良”关系研究

第一章绪论

中药复方是在中医药理论整体观以及辨证论治的思想指导下形成的，已有几千年的应用和发展，由简到繁，从单味药到药对，再到复方。中药复方配伍规律的合理性在长期预防疾病的实践中已被确证，多组分、多IE点的综合调节作用使其成为中药应用的主要形式，是中药的灵魂也是其优势所在。然而，这一优势也成为中医药研究者的难题，因为中药复方的治疗作用不是单个成分的简单相加，其化学成分的复杂性、药效的多样性和中医临床应用的辨证施治，使得其配伍规律研究一直困难重重，虽然复方临床效果较好，却缺乏新时代下的合理性阐释。药对，是在复方配伍中经常成对出现的药物，是单味药和复方之间的最基本的组成单位[1_2]，是沟通单味药与复方之间的桥梁。所以，通过现代科学技术，从细胞、组织、整体动物到人体实验证实和发掘药对配伍的有效性、合理性和科学性，从而为中药复方研究提供经验和借鉴。本章概述了药对配伍的研究现状，介绍了 “良”关系药对远志-石菖蒲的现代研究进展，阐述了 P-糖蛋白在药物相互作用中的重要性，进而阐述了本论文的主要研究内容及研究意义。

1.1 “良”关系的提出
张伯礼、王永炎院士[3]共同提出研究中医复方应该按照“复杂一简单一复杂”的路线。药对作为中药学特有的一种配伍形式，疗效确切，具有复方的特性；配伍简单，易于探讨配伍规律；配伍严格，是构成复方的小单元，是关联繁多复方的纽带。以药对为切入点，从中药药对配伍的研究入手，可以化繁就简的认识复方配伍关系的科学内涵。
《黄帝内经》一书有用到乌贼骨、蘆苑共同预防"血枯”证[4]。随着人类防治疾病经验的不断增长，药物相互作用的“七情合和”理论也随之出现。《神农本草经·序例》指出：“药有单行者，有相须者，有相使者，有相畏者，有相恶者，有相反者，有相杀者，凡此七情，合和视之。当用相须相使者良，勿用相恶相反者”。中药复方配伍的首要目标就是增效减毒。
中药“七情”指的是单行、相须、相使、相畏、相杀、相恶、相反七大类别。单行指单味药物治疗；相须指性能功效相似的药物配伍使用，两种药物的疗效都会提高；相使指性能功效方面有近似的药物可以一起使用，辅药能够提高主药的效果；相畏是说一种药物的毒副作用可以被另一药物减轻或消除；相杀是说一种药物能减除另一药物的毒副作用；相恶是说一种药物可以降低另一种药物的本来作用，或者使这种药物彻底失去其治疗功能；相反指两种药物联合使用时可以发生毒副作用。其中“相须”、“相使”是“七情”配伍中具有协同增效的配伍关系，这种关键配伍关系可称之为“良”关系。
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1.2药对配伍的研究进展
1.2.1药对配伍的化学研究
中药中含有多种成分，这些化学成分是中药起效的物质基础，化学成分的变化会影响药物对疾病的防治作用。选择药对中单味药的代表性成分、或者药对配伍后产生的新成分作为有效指标，对明确药对的药理药效，保证临床用药安全性都有现实意义。
目前，对中药药对配伍的化学研究主要包括配伍前后化学成分的监控研究。由于中药煎煮过程中，受高温、水溶液环境pH值等原因的影响，药物成分的质和量都发生了变化，这些物理和化学变化使得配伍呈现出增效减毒的作用。对于“相须” “相使”药对来说，药物配伍可以起到增效作用，如陈建萍等[5]对四逆汤中生物碱的变化进行测定，发现甘草可以减少附子中生物碱含量，从而避免了附子对人体的毒害。对于“相畏” “相杀”药对，可以起到减毒的作用效果，如半夏配伍生姜后，吴始等[6]研究发现生姜可减弱半夏提取物对小鼠腹腔的刺激性，这种作用是通过保护胃粘膜等实现的。吴嘉瑞等[7]研究人参与莱菔子配伍后，与人参单煎组比较，人参总苷Rgl的溶出度降低，表明莱菔子有措抗人参的作用。
1.2.2药对配伍的药理研究
从药理药效学角度研究中药药对配伍机制较为常见，随着药理学、分子学、细胞生物学技术的发展，药理研究水平也从整体动物、离体组织层面进展到血清药理、细胞、分子水平上[8]。刘慧兰等[9]研究发现桂枝-白苟配伍、柴胡-白苟配伍可以增加单一药物对小鼠的抗炎镇痛效果，这说明药物之间具有协同作用。雷波等_对附子配伍不同的中药，如干姜、生地黄、黄苗、人参以及甘草后，小鼠半数致死量降低，这说明其他药物可以降低附子中乌头类生物碱的毒性，从而增强小鼠的耐受能力。梁R欣等[11]通过检测病理模型大鼠血清中的两二醛指标，发现血府逐瘀汤中赤苟与川考合用后，可以明显提高一氧化氮气体的排放。王伟等[12]研究丹参-山楂药对对大鼠动脉粥样硬化的作用，发现同高脂饮食诱发的大鼠髙脂血症模型组比较，配伍给药组的各项病理观测指标，如大鼠血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋.白等均有所下降，高密度脂蛋白水平和超氧化物歧化酶活力增高。
1.2.3药对配伍的最佳量效配比研究
药对中两味中药不同比例的配比可能代表药对整体化学成分在质或量上的不同，对于其功效产生很大影响，因此对药对配伍的最佳量效配比研究也是探讨药对配伍规律的一个重要方面。通过研究药物不同比例给药后的疗效，从而探讨药对中两种药物的最佳用量比例。林丽美等[13]研究发现，金银花-连翅药对水煎液1 ： 1配伍时，抗炎、解热作用强于金银花、连翅单用。罗尚风等[14]对白术-枳实药对进行配伍比例研究，发现白术和枳实以2 ： 1和1 ： 2比例配伍时，白术中有效成分苍术酮的代谢产物含量逐渐减小。史旭序等[15]制作小鼠血虚模型，对当归：黄苗不同配比（0 ： 1、1 ： 5、2 ： 5、2 ： 3、1 ： 1、3 ： 2、5 ： 2、5 ： 1、1 ： 0)时养血补血功效进行研究，研究发现，不同配比组的药效也不一样。季旭明等[16]借助动物实验研究，发现黄连、肉桂以10: 1配伍使用时，对小鼠的安神作用最好。
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第二章石菖蒲对P-糖蛋白功能和表达的影响

p-gp可以介导肿瘤药物的外排，这是造成肿瘤多药耐药现象的关键因素[135_136]。p-gp在各种肿瘤细胞以及很多正常组织和器官中（心，肝，肾，肠，脑和睾丸等）存在，从而对药物在体内的转运过程产生影响[137_139]。己知某些药物如地塞米松、环抱素A等可诱导P-gp的表达；维拉帕米、姜黄素和厚朴酸等可抑制P-gp的表达，从而影响药物在细胞内的含量。
MTT比色法是常用的考察细胞存活能力和生长状况的实验方法。它耗费低，用时少，灵敏度高。MTT能够干扰活细胞线粒体中的呼吸链反应，它可以和活细胞中的號拍酸脱氧酶反应，转化为不溶性的蓝紫色沉淀物，细胞的活性越强，甲月赞结晶的产生量也就越多。甲月赞结晶可用有机溶剂，如二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解，借助酶标仪测定490nm处甲月赞溶液的光密度吸收值，并与正常细胞组进行比较，来判断死亡细胞的比率。
罗丹明-123 (Rhodannne-123, Rhl23)是P-gp的特异性底物，这种焚光染料发生的突光为黄绿色，能够进入活细胞内，然后利用仪器对劳光进行观测。Rhl23对细胞不会产生毒性，所以通常用来实验中评价P-gp的功能活性。当使用P-gp抑制剂抑制P-gp的功能时，可以使Caco-2细胞增加对Rhl23的摄取，使Rhl23的外排量将减少。
流式细胞术是常见的一种检测单个细胞或者其他小分子的手段，并可以进行定性定量快速分析，可以从同一检测对象中，如细胞获得多个观察参数，具有高速、高精度、高准确性等优点。
a-细辛醚及yS-细辛醚(见图2-1)是石菖蒲挥发油中的主要活性成分，本章使用MTT法测定石菖蒲挥发油、a-细辛醚及;5-细辛醚对Caco-2细胞的毒性；采取流式细胞术观察石菖蒲挥发油、ct-细辛醚、a-细辛醚对Caco-2细胞摄取和外排Rhl23量的变化，考察其对P-gp功能的影响；采取流式细胞术考察石菖蒲挥发油、ct-细辛醚、细辛醚对P-gp蛋白表达的影响，并利用RT-PCR法考察药物对细胞MDR1 mRNA表达的影响。


2.1石菖蒲对Caco-2细胞的毒性研究
2.1.1仪器与材料
1、仪器
二氧化碳培养箱（MCD-15AC，SANYO,日本)，生物洁净工作台（MCV-131BNF，SANYO,日本），倒置相差显微镜(CK40-32PH,SANYO,日本），湿热灭菌器(MOV-313P，SANYO，日本)，台式离心机（Heraeus LabofUge 400R，Thermo Fisher,美国），酶标仪(Spectra Max 340PC, Molecular Devices,美国），超纯水机（SA-2100E1，EYELA,日本)，冷冻干燥机（FD-5N，EYELA, Japan), 25cm2细胞培养瓶（Costar，Coming,美国），96孔细胞培养板（Costar，Coming,美国）。
2、材料与试剂
Caco-2细胞株（购自中国科学院上海细胞库)，《-细辛醚（Sigma，美国）、；5-细辛醚对照品（Sigma，美国）、四甲基偶氮唑盐（MTT，Sigma,美国）、二甲基亚砜（DMSO，Sigma，美国）、长春新碱（广东岭南制药有限公司）维拉帕米（Verapamil，Ver，上海未丰制药有限公司），Dulbecco's Modified Eagle's Medium培养基（DMEM,高糖型，Gibco，美国），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），实验用水为自制超纯水，其他试剂均为分析纯。远志药材来源于远志科植物远志Polygala tenuifalia Willd.的干燥根，石菖蒲药材来源于天南星科多年生草本植物石菖蒲Acoms! tatarinowii Schott.的干燥根蒸，均购自西安市药材市场，由西北大学生命科学学院房敏峰老师鉴定。
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2.2石菖蒲对罗丹明-123摄取和外排的影响
由MTT实验可知，石菖蒲挥发油、ct-细辛醚、）a-细辛醚对P-gp具有抑制作用。本实验将借助流式细胞术，进一步通过观察石菖蒲挥发油、a-细辛醚、β-细辛酸对Caco-2细胞摄取和外排Rhl23量的变化，考察其对P-gp功能的影响。
2.2.1材料与方法
1、仪器
C02 培养箱(MCD-15AC，SANYO，日本)，生物洁净工作台(MC V-131BNF，SANYO，曰本)，倒置相差显微镜(CK40-32PH，SANYO,日本），湿热灭菌器(MOV-313P，SANYO,曰本），台式离心机（Heraeus Labofuge 400R，Thermo Fisher，美国），流式细胞仪(FACScalibur，Becton Dickinson,美国），酶标仪（Spectra Max 340PC, Molecular Devices，美国），超纯水机（SA-2100E1，EYELA,日本)，25cm2 细胞培养瓶（Costar，Coming,美国），96孔细胞培养板（Costar，Coming,美国），0.22 nm微孔滤膜过滤器（Millipore,美国）。
2、材料与试剂
Caco-2细胞株（购自中国科学院上海细胞库)，Rhl23 (Sigma,美国），a-细辛醚、A细辛醚对照品（Sigma，美国）、MTT (Sigma,美国）、二甲基亚砜（DMSO，Sigma,美国）、维拉帕米（Verapamil，Ver，上海未丰制药有限公司），DMEM培养基（高糖型，Gibco，美国），FBS (杭州四季青生物工程材料有限公司)，胰蛋白酶（Amresco,美国），实验用水为自制超纯水，其它试剂均为分析纯。石菖蒲药材（购自西安市药材市场，由西北大学生命科学学院房敏峰老师鉴定)。
2.2.2实验方法
1、实验溶液的配置
(1) MTT溶液（5mg*mri)的配制
准确量取100 mgMTT粉末置于烧杯中，避光，加入20mLPBS溶液，超声溶解，过滤除菌采用一次性0.22 μm微孔无菌针头滤器，分装至小离心管中，4°C冷藏，溶液的使用有效期不要超过1周。
(2)石菖蒲挥发油供试品溶液制备
取干燥至恒重的石菖蒲粉末(24~65目)200.0 g，置于2000 mL圆底烧瓶中，按照药典挥发油测定法（附录XD)测定，收集石菖蒲挥发油，加入DMSO溶解，制备挥发油供试品溶液，母液浓度为0.5g-mL，4 °C冷藏备用。
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第三章肠囊外翻法研究石菖蒲对远志肠吸收的影响...................................... 38
3.1仪器与材料...................................... 38
3.2实验方法...................................... 39
3.3结果与讨论...................................... 41
3.4本章小结...................................... 49
第四章老年性痴呆模型的建立...................................... 51
4.1仪器与材料...................................... 51
4.2实验方法...................................... 51
4.3结果与讨论...................................... 53
4.4本章小结...................................... 55
第五章远志-石菖蒲体内药代动力学研究...................................... 56
5.1远志中活性成分血浆研究方法的建立...................................... 56
5.2石菖蒲中活性成分血浆研究方法的建立...................................... 63
5.3石菖蒲对远志在大鼠体内药代动力学的影响研究...................................... 71
5.4远志对石菖蒲在大鼠体内药代动力学的影响研究...................................... 74

第六章石菖蒲对远志体内组织分布旳影响

本章建立了远志药材中活性成分TMCA在大鼠组织内的高效液相色谱分析方法，考察石菖蒲对TMCA在正常、模型大鼠体内组织分布的影响。旨在探析石菖蒲“芳香开穷，引药上行”的作用机制。

6.1大鼠组织中TMCA的HPLC分析方法的建立
6.1.1仪器与材料
Agilent 1100高效液相色谱仪（Agilent，美国），万分之一天平（BP221S，赛多利斯，德国)，SA-2100E1型超纯水机（EYELA，日本)，GL-25MS高速冷冻离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司），Vortex-5型快速混勻器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司），BF2000氮气吹干仪(北京八方世纪科技有限公司)，DY-89-II型电动玻璃勻衆机（宁波新芝生物科技股份有限公司）。
TMCA (纯度>99%，上海郎中堂化剂公司），肝素钠注射液（上海第一生化药业有限公司），色谱甲醇（天津市科密欧化学试剂有限公司），其他化学试剂规格都为分析纯。
健康SD大鼠，SPF级，体重250~280g，购买自广东省实验动物监测所，许可证号：SCXK (粤）2008-0002。
6.1.2供试品溶液的制备
1、对照品溶液的制备
精密称取TMCA 10.0 mg，用甲醇溶解于10.0 mL容量瓶中，制备浓度为1.0 mg-mL-1的对照品溶液，0.45μm有机滤膜滤过，4 °C冷藏备用。
2、空白组织匀浆液的制备
健康SD大鼠禁食12h，处死取出心、肝、脾、肺、肾、脑后，放入液氮中，使之迅速冷冻。脏器于室温自然解冻后用0.9%生理盐水冲洗，再用滤纸吸千组织表面残存的水分，精密称量脏器，加入1.5倍量0.9%生理盐水，在冰浴条件下，500 rpm勻衆10.0min,得到心、肝、脾、肺、肾、脑的勾楽液，于冰箱-8(rC保存。
3、空白组织样品供试品溶液的制备
取空白组织匀浆液解冻，8000 rpm离心10.0 min,取上清液0.2 mL,加入0.6 mL乙腈沉淀蛋白，祸漩2min，8000 rpm离心，取上清液，下层沉淀加入40 |aL10%三氯乙酸，润漩Imin, 0.6 mL乙酸乙酯萃取，祸漩2 min后离心10 min,乙酸乙醋萃取两次，移取两次萃取上清液与第一次乙腈提取液合并，N2保护吹干。残渣用甲醇-0.2%甲酸水溶液(25 :75, FVF)超声溶解，0.45μ m微孔有机滤膜滤过，4 °C冷藏备用。
4、空白组织匀浆液加对照品供试品溶液的制备
取空白组织勻菜液解冻，8000 rpm离心10.0 min,移取上清液0.2 mL,加入40 μLTMCA对照品溶液，祸漩，制备一系列浓度的空白组织勻菜液加对照品的供试品溶液。
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结论与展望

本论文基于“良”关系，选择常见的治疗老年性痴呆的“相使”药对远志-石菖蒲为研究对象，借助P-糖蛋白调控研究、肠外翻模型研究、药代动力学研究手段，从分子、细胞、离体组织、整体动物四个层面，对远志-石菖蒲药对的配伍机制进行研究，阐释石菖蒲“芳香开齊、引药上行”之增效作用。主要包含以下研究结论：
1、基于《神农本草经》中所载“当用相须、相使者良”，选择“良”关系药对远志-石菖蒲作为研究对象，驳繁就简、以研究药对相互作用为切入点，有望阐释中药复方配伍规律。2、借助Caco-
2细胞模型，通过研究远志、石菖蒲对细胞以及细胞上P-糖蛋白的作用，从分子、细胞水平揭示石菖蒲具有抑制P-糖蛋白功能和表达的作用，远志中含有P-糖蛋白作用底物，二者通过P-糖蛋白调控产生相互作用。
3、研究远志活性成分TMCA和石菖蒲配伍前后，TMCA在肠外翻模型上吸收行为的改变，发现石菖蒲可以通过抑制肠段上的P-糖蛋白，增加TMCA在肠段的吸收，从离体组织水平阐释石菖蒲协同增效的作用。
4、制作老年性痴呆模型大鼠，对远志、石菖蒲单用及配伍前后，正常、模型大鼠体内远志、石菖蒲活性成分群的药代动力学行为进行研究，发现，石菖蒲可以提高远志中TMCA在大鼠体内的吸收，远志也可改变石菖蒲成分群的药代动力学行为。从整体动物水平验证远志-石菖蒲药对的体内代谢存在相互作用，进而揭示其配伍之“良”关系。
5、研究石菖蒲对远志成分TMCA在正常、模型大鼠体内组织分布的影响，发现石菖蒲可以提高TMCA在各组织中的分布。TMCA在脑中含量升高，有助于阐释石菖蒲通过调控P-糖蛋白功能，从而发挥“芳香开穷、引药上行”作用机制。
本论文对远志-石菖蒲药对配伍进行研究，可为中药复方配伍规律研究提供思路，亦可为临床用药合理性提供佐证。然而，要系统揭示药对配伍之“良”关系，还需进行全面的长期研究。作者认为，可从以下几点进行探索：
1、在远志体内代谢研究中，发现了众多未知的吸收入血的药材成分群和代谢物群，这些物质在石菖蒲配伍使用后发生了变化，可借助数学统计方法，寻找其中与石菖蒲体内代谢具有相互作用的成分，对其进行结构确认，探求远志-石菖蒲配伍“良”关系的体内效应物质基础。
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参考文献（略）