GC-MS法研究DXS磷酸丙糖异构化活性机理

第一章绪论

1.1疏类化合物(terpenoids)简介
生物机体内的代谢产物按其功能可以分为两大类：初级代谢产物和次级代谢产物。次级代谢产物又被称之为天然产物，蔽类化合物(terpenoids)是自然界中分布广泛，种类繁多的一大类天然产物家族，根据其基本结构组成单元又被之为类异戊二稀化合物(isoprenoids), 一般是符合(CsHg)n结构通式的化合物以及其衍生物⑴，但有一些蔽类化合物经过环化，重排以及碳骨架修饰等化学反应结构变复杂，很难直观辨别出来。目前为止，科学工作者[2]发现的生物体内蔽类化合物最基本五碳单元有两种：异戊稀基焦磷酸(isopentenyldiphosphate)和二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyl diphosphate)。
蔽类化合物存在于几乎所有生命形式中，目前发现的蔽类化合物也有近4万种[3],但是仅对其中很少的一部分有较深入的研究，因此针对蔽类化合物，特别是其在生物体内的合成及代谢途径，生理活性等方面的深入研究，对于揭示生命活动的物质基础、进化史以及新药的研发有着非常重要的意义。
1.1.1 11类化合物类别
目前蔽类化合物一般是根据其组成结构单元的数目来进行简单分类，例如最简单的蔽类化合物一异戊二烯，它只有一个基本的五碳单元，我们称之为半蔽(hemiterpenes)；单祐(monoterpenoids)是由两分子的基本单元所构成的Qo化合物，三分子五碳单元则构成一分子倍半萌(sesquiterpenoids),依此类推，还有二萌(diterpenoids)、三蔽(triterpenoids)和四蔽(tetraterpenes),再往上则统称为多蔽(polyterpenes),其中倍半蔽种类最多，约七千多种[4_5]。单蔽和倍半蔽多分布在植物挥发油中，多以酮、醇、酯的形式存在，三蔽在生物体内则主要以阜苦的形式存在[6_9]，图1.1为几种常见蔽类化合物的结构式[10]。

1.1.2疏类化合物生理生态学作用研究概况
近些年来，随着广大科研工作者越来越深入的研究，蔽类化合物越来越多的生理学、生态学方面的重要作用也逐渐地被揭示和发现[11-12]。
1.1.2.1单疏和二蔽类化合物
机体内，单萌和二蔽分别由香叶基焦憐酸(geranylpyrophosphate)和香叶基香叶基焦磷酸(geranylgeranyl pyrophosphate)衍生而来。单蔽通常是植物香精中的重要成分[13],例如：松节油中的菠稀（蒞稀型化合物），重要的香料原料龙脑（蔌稀型化合物），水序稀、松油烯（蔽稀类），香叶醇、香茅醇、芳樟醇（醇类）等，具有很高的经济效益；
二蔽及其含氧衍生物多具有生物学活性[14]，例如：维生素A，属于单环二蔽类化合物，是机体内重要的一种脂溶性维生素，维持正常的夜间视力和哺乳动物生长必不可少；穿心莲内酯是一种二环二蔽类化合物，中药穿心莲iAndrographispaniculata)抗菌消炎的活性成分；雷公藤根中分离出来的雷公藤甲素是一种三环二蔽类化合物，具有抗癌活性，其衍生物之一雷公藤内酷醇具有较强的抗炎、抗免疫和抗生育作用，另一种三环二蔽类化合物关附甲素是中药关白附中抗心律失常的活性成分；此外，还有近些年研究很热的抗癌化合物紫杉醇(tool)等[15_18]。
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1.2常用化学衍生方法简介
在气相色谱分析中，常有一些样品因为自身的性质或者体系过于复杂，不适合直接分析，需要进行预处理，最常用的方法就是将预分析的样品通过化学衍生的方法转变成另一种化合物，这一过程称为衍生物的制备，通过合适的化学衍生方法，可以提高检测器对待检测样品的检测灵敏度；提高化合物的挥发性，增加化合物的热稳定性；对于成分复杂的样品，也可以通过转化为衍生物的方法除去样品中的一些杂质化合物，使待测化合物更容易被分离出来，从而增加待检测样品进行GC或者GC/MS分析的可行性以及准确性。GC和GC/MS分析最常用的衍生方法主要有桂烧基化法、焼基化法、酰化法等[68]。
1.2.1 娃院基化法(silyktion)
1.2.1.1甲基娃院化反应
甲基硅焼化反应最初是用于有机合成反应中用来保护一些活性基团的，后来逐渐用于气相色谱和GC-MS分析中，桂焼基化就是指用硅烧基(RsSi-)来置换目标化合物中的轻基、氨基、巯基、接基以及酷胺基等基团中的活拨氢的反应，而用于此反应的有机桂化物被称为桂烧化试剂[69]。反应过程如图1.10

桂烧基化后，由于占据了化合物的活拨位点，导致极性减小以及活性氢数目减少，使难挥发的物质变成易挥发的化合物，热稳定性增加，也会引起化合物的溶解性发生变化，譬如原本在苯以及甲苯中难溶的物质变成可溶性物质。对于多糖类、氨基酸类、多肽类、核酸、留体类化合物等天然有机物它们本身不具有挥发性，故而不能进行气相色谱和质谱分析，但是含有许多轻基、氨基和幾基，若将其进行桂烧基化，则可转变为低沸点的化合物，有进行气相色谱和质谱分析的可能。例如色氨酸，其溶点达到了 29(rc，难挥发，也不溶于有机试剂中，用三甲基氯硅烧进行桂焼基化后，则沸点降到了 14(rc,并且能溶于苯中，如果将(CH3) 3Si-取代为H (CH3) 2Si-,则产物的沸点会更低。桂院基化可以增加化合物的热稳定性，例如二特丁基过氧化物((CH3)3C00C (CH3) 3)的三甲基桂焼化物的稳定性就要比其本身的热稳定性要好很多[70_71]。
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第二章EcDXS的诱导表达及其酶活性检测

2.1实验材料与仪器
2.1.1菌株
工程菌BL21(DE3)-EcDXS为本实验室保存。
2.1.2实验试剂

2.1.3实验仪器

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2.2实验方法
2.2.1实验中主要溶液的配方
(1)LB液体培养基：分别称取5g酵母提取物，lOg胰蛋白胨，lOgNaCl,溶解于800mL二次蒸懷水(ddlfcO)中，然后用2MNaOH调pH至7.0,再用ddH2O补足体积至1L，于12rC下高压灭菌20min后4°C保存。
(2) LB画体培养基：分别称取0.5g酵母提取物，Ig胰蛋白胨，IgNaCl，1.5g琼脂，溶解于90mL ddH20中，然后用2M NaOH将pH调至7.0，再用ddlfcO补足体积至lOOmL,121°C高压灭菌20min,待培养基冷却至60°C左右时分装入5-6个已灭菌的培养皿中，待培养皿中的培养基凝固后，用封口膜密封，倒置于4°C保存备用。
(3)氨节青霉素(Amp)储存液：称取O.lgAmp，溶解于900fiL无菌水中，使其终浓度为lOOmg/mL,分装后于-20°C冻存备用。
(4)异丙基-P-D-硫代Pit喃半乳糖苷(IPTG) le存液：称取0.24g IPTG,溶解于lOmL无菌水中，使其终浓度为lOOmM,用0.45pim的滤膜过滤后分装，于4°C保存待用。
(5)磷酸盐缓冲液(PBS，pH =7.5)；称取Na2HP04 1.54g，NaCl 8g, KH2PO4 0.2g,KCl 0.24g 溶解于 900ml ddH20,用 2M NaOH 调 pH 至 7.5，ddHzO 补足体积至 IL, 121°C高压蒸汽灭菌20min，4°C保存待用。
(6)菌体裂解液(Lysis buffer):称取0.05g溶菌酶，用lOmL PBS (pH=7.5)溶解，现用现配。
(7) 30% (w/v)丙稀酰胺单体混合液：称取丙稀酸胺29.10g, N’N-二甲叉丙稀酰胺0.9g,加80ml ddHiO溶解，用ddH2O补足体积至100ml, 4°C避光保存。
(8)分离胶缓冲液：称取18.16g Tris,溶于80ml ddHzO,用4M HCl调pH至8.8较用ddl^O补足体积至lOOmL，4°C避光保存。
(9)浓缩胶缓冲液：称取12.12gTris，溶于80ml ddHaO，用4M HCl调pH至6.8，用ddltO补足体积至100ml，4°C避光保存。
(10) 10%过硫醜胺(APS):称取0.1 g过硫酰胺，溶于900nLddH20中，现配先用。
(11) 10% (w/v)十二烧基磺酸钠(SDS):称取10 g SDS,溶解于80ml ddl^O赛用ddHjO补足体积至100ml,室温保存。
(12) 12%分离胶：量取分离胶缓冲液2.5ml，30%丙稀酰胺单体混合液4ml, 10% SDS0.1ml，ddH20 3.3ml, 10%APS 0.1 ml, TEMED 0.02 ml,混勻后快速加到制胶器中，加0.2ml无水乙醇压平液面。
(13) 3.5%浓缩胶：量取浓缩胶缓冲液0.765ml，30%丙稀酷胺单体混合液0.54mL，10%SDS 0.045mL, ddHiO 3.15mL, 10% APS 0.019 mL, TEMED 0.015 mL,混勻，倒去制胶器中的无水乙醇，快速将浓缩胶加到制胶器中。
(14) 2倍电泳载样缓冲液(2xLoading Buffer):分别量取0.1%溴酷蓝10 mL，甘油10mL, 1M Tris-HCl (pH6.8) 6.3mL, P-巯基乙醇(p-ME) 10 mL,再加入 SDS 5.0g，然后用ddltO补足体积至50 mL,混匀后于4°C保存待用。
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第三章丹皮酚及其衍生物对DXS异构化活性的影响.................................... 32
3.1实验试剂和仪器.................................... 32
3.1.1 试剂.................................... 32
3.1.2 仪器.................................... 33
3.2实验方法.................................... 33
3.2.1 D-甘油醛-3-磷酸的合成.................................... 33
3.2.2助溶剂对反应体系的影响.................................... 35
3.2.3丹皮酚及其衍生物对DXS异构化活性的抑制.................................... 35
3.2.4 D-GAP的回收率实验.................................... 36
3.3实验结果及分析.................................... 36
3.3.1 D-GAP 的 1H-NMR 结果.................................... 36
3.3.2 D-GAP的纯度检测结果.................................... 36
3.3.3助溶剂对反应体系的影响.................................... 37
3.3.4对化合物本底吸收的考察结果.................................... 38
3.3.5丹皮酷及其衍生物对DXS异构化活性的抑制结果................................. 38
3.3.6 D-GAP的回收率实验结果.................................... 39
3.4本章小结.................................... 40

第四章娃焼化法研究

DXS异构化机理磷酸二轻丙酮和 D-甘油酸-3-磷酸作为两种互为同分异构体的天然丙糖(结构如图4.1), 二者本身的沸点较高，不具有挥发性，不能直接进行GC-MS分析，桂烧基化衍生法作为常规的气相色谱化学衍生法，能够降低样品化合物的沸点，从而使目标化合物进行GC-MS分析变为可能。DHAP与D-GAP都具有活拨氢，实验室选用N,0-双（三甲基娃烧基）三氟乙酰胺(BSTFA，with 1% TMCS)作为桂烧化试剂，其可能的反应过程如图4.2所示：


4.1实验材料
4.1.1主要试剂

4.1.2主要仪器

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总结

本课题组在MEP途经的关键酶DXR、DXS等酶的研究过程中，发现DXS除了有转酮酶活性，能够催化合成DXP以外，还具有类似憐酸丙糖异构酶的活性，即能够催化两种天然磷酸丙糖D-甘油醛-3-憐酸(D-GAP)与憐酸二经丙酮(DHAP)的互变异构反应，研究这一过程中DXS的催化机理有着很重要的意义，能够有助于DXS酶抑制剂的研究，为新型抗生素的研究提供理论依据。
本课题组已经做好了大量的基础工作，包括大肠杆菌(E.coli)’铜绿假单胞杆菌iP.aeruginosa)的dxs基因研究，Ec.DXS以及Pa.DXS的克隆表达及纯化、Ec.DXS酶的酶动力学参数和酶活力的研究以及重要底物D-GAP以及DXP的合成及氖标记化合物的合成方法，相关化合物检测方法的研究等。
D-GAP和DHAP两种憐酸丙糖不具有挥发性，不能直接进行GC-MS分析，这为DXS的异构化活性机理的研究带来了很大的阻碍，本研究旨在建立一种合适的化学衍生方法，通过对两种憐酸丙糖衍生化（如桂焼化或醜化反应）使之适合进行GC-MS分析，再采用原位氖标记的方法，揭示DXS酶催化异构化过程中质子迁移的情况。有相关文献报道表明D-GAP与DHAP的衍生化后进行GC-MS分析具有可行性，为本实验提供很好的依据，但是操作过程极为复杂，在更新的研究技术与检测技术的支持下，我们建立了一种更加简单，灵敏的方法，为相关的研究工作提供一种可靠的工具。
本文首先采用常规的蛋白表达和纯化技术制备了一批纯度较高且活性良好的EcDXS,然后采用柱前衍生高效液相色谱法检测了丹皮酹及其衍生物45种化合物对EcDXS的抑制活性。研究表明部分丹皮酌衍生物对EcDXS憐酸丙糖异构化活性的影响明显，如化合物34在浓度为O.lmg/ml时对酶的抑制活性达到31.6%。
此外，本文还尝试采用桂烧化-GC-MS法分析EcDXS催化磷酸丙糖异构化的反应机制。在该研究中首先采用N，0-双（三甲基桂焼基）三氣乙酷胺(BSTFA)分别对DHAP以及D-GAP进行了桂焼化反应，并对反应时间和温度进行了优化，初步建立了这两种天然憐酸丙糖的桂焼化-GC-MS检测方法。我们利用所建立的方法分析了 DXS催化D-GAP和DHAP异构化反应的结果，在以D-GAP为底物进行异构化反应的样品中检测到了 D-GAP的桂烧基化产物.通过LC-MS的辅助分析发现，D-GAP和DHAP在失去磷酸基团并被2,4-二硝基苯肼(DNPH)衍生为苯腙分离度更高，故拟用二者的去憐酸基团产物D-甘油酸(D-GA)和二轻丙酮(DHA)为模型化合物进行硅烧基化和酰化研究，相关工作正在进行中。
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参考文献（略）