在体海马区电活动受以钾离子通道为靶点的抗癫痫药物的影响分析

第 1 章 引言

1.1 癫痫背景介绍
癫痫是一种常见的以大脑神经元异常放电引发突然短暂反复发作为特征的神经系统疾病，表现为运动、感觉、意识、精神、植物神经等多方面障碍，严重威胁人类生命与健康[1,2]。目前全世界约有 5000 万的癫痫患者，而我国癫痫患者就超过 900 万，每年 1 万人当中有 20-70 新增病例[3]。药物是癫痫治疗的首选手段，约 65%-70%的病人通过抗癫痫药物可以得到缓解，但还有约 30%的癫痫患者不能得到有效控制而发展为难治性癫痫，成为中枢神经系统疾病中的一大顽症[4,5]。研究癫痫尤其是难治性癫痫的病因、病理和治疗机制，对寻找有效的治疗方法显得尤为重要。
目前，癫痫确切的发病机制并不明确，但已有研究表明癫痫的发生主要与神经递质、离子通道、星形胶质细胞以及免疫系统等有关[6]，可以大致分为三种主要因素：（1）先天遗传，如离子通道病被推测是癫痫发作发生的一个重要致病因素。离子通道的任何改变都可能紊乱人体的正常功能，造成中枢神经系统电活动的失衡，最终诱发异常同步化放电，从而导致癫痫发作。（2）由某种潜在诱因如脑外伤、中风、脑部感染或其它刺激导致的具有可被识别病变区的症状性癫痫。对人类癫痫以及啮齿类实验动物癫痫发作的研究数据表明，不同的癫痫发作可能存在不同的病理损伤作用，如癫痫持续状态之后的脑双边和颞叶的损伤巨大，包括杏仁核复合体、海马、梨状体以及鼻皮质等，而由创伤性脑损伤或中风诱发的癫痫，其脑损伤单一，脑部病灶周围的顶叶部位损伤最为严重，与癫痫持续状态相比涉及不同的核团[7]。受损核团的细胞大量发生改变，包括细胞死亡、胶质细胞增生、神经新生、轴突和树突可塑性、细胞外基质重排以及血管生成等[8,9]。由于大脑各核团神经元的突触联系，使得一种或几种核团的病理结构的变化可能影响到其它投射核团神经元的生理特性，进而引起神经网络结构功能的改变，最终导致中枢神经系统神经元的超同步化放电，引发癫痫发作。（3）不明因素[5,10]。由于癫痫发病诱因不同，因此其发病机制也是复杂化、多样化。
癫痫是一个逐渐改变神经元兴奋性的动态过程，在首次自发发作发生前可能有错综复杂的结构变化[11]。颞叶癫痫属于最常见的难治性癫痫，典型的病理改变是海马结构的硬化和萎缩，累及海马和海马旁结构等边缘网络[12-15]，提示海马很可能是引起颞叶癫痫发生的关键结构。因此，我们选择海马区域作为研究核团。正常大鼠海马场电位有三种特征，慢波睡眠期，滤波 150-250 Hz，场电位不规则波形，伴随 ripple 振荡；在快速眼动睡眠期，场电位呈典型的 theta振荡；清醒活动中，场电位以 theta 为主，并有 gamma 振荡[16,17]。在人类颞叶癫痫患者和实验性动物癫痫模型上研究证明，单个海马神经元电活动异常是促进神经元之间兴奋连接﹑产生爆发式放电的重要因素[18-20]。爆发式放电可自发产生一串高频动作电位，串内动作电位数目为 2 个或 2 个以上，频率可高达 200 Hz以上，随后是持续数十毫秒的后超极化，并能募捐其它神经元产生同步化放电[21]。不仅如此，癫痫大鼠场电位出现异常，大幅棘波，节律性强，出现频率 8-12Hz，与 theta 节律频段相一致。大鼠神经兴奋性转运递质与抑制性转运递质之间的不平衡导致癫痫样的活动[22,23]。虽然现有的研究可通过行为学、脑电图对癫痫进行诊断，利用原始的组织学技术对脑部核团如海马神经元的细胞形态变化进行研究，并进一步运用核磁共振成像技术使人们对识别大鼠或小鼠个体病变以及跟随癫痫发病的进展变成可能[24-26]，但相关研究只局限于脑区某一断面切片。
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1.2 瑞替加滨抗癫痫作用机制研究
抗癫痫药物中，瑞替加滨（Retigabine，化学式见图 1-1）是 2011 年被美国食品药品管理局批准上市的用于成人部分发作性癫痫治疗的 KCNQ 钾通道激动剂[29]。KCNQ 通道开放促进钾离子外流，胞外钾离子增加导致细胞膜的超极化，从而降低神经元的兴奋性，最终呈现抗癫痫效应[30]。

M 型电流为 KCNQ 通道介导的阈下缓慢激活电压门控性钾离子电流，对于维持膜静息电位与神经元兴奋性起重要作用[31]。M 通道持续开放，且呈非失活特性，控制动作电位的产生和频率，使细胞复极化来调节神经元兴奋性[31]。因此，增加 M 通道功能的调节作用，在一定程度上会降低神经元兴奋性。瑞替加滨增加神经元 M 型钾电流，改变其激活的电压，浓度依赖性的（1-10 μM）减弱长时间去极化刺激所致的大鼠海马锥体神经元高频率爆发式发放模式，但同样浓度的瑞替加滨对短时程去极化刺激产生的动作电位没有影响[32]。对海马中间神经元，瑞替加滨抑制动作电位产生过强去极化的数量达到减少中间神经元的兴奋性[33]。从 17 个进行手术病人取皮层切片，瑞替加滨能降低自发尖波的发放次数[34]。前人及本实验室的体外实验证明瑞替加滨可增强除 KCNQ1 外的所有KCNQ 通道，并可以抑制神经元放电（图 1-2）[35]。V.Armand 报道在海马切片中，瑞替加滨显著性的减少 4-AP 所致海马癫痫样放电[36]。瑞替加滨对在胶状质细胞由 4-AP 诱导产生的兴奋上有明显镇静作用[37]。小鼠皮下给予 4-AP，活动明显增加，前直强直，无序的奔跑[38,39]。有研究报道瑞替加滨能逆转 XE991导致的神经细胞的发放[40]。另有研究报道瑞替加滨对神经元 GABA 电流及GABA 的分泌也有增强作用[41]。

图 1-2 瑞替加滨激活 KCNQ2 通道，使 G-V 曲线左移（A）转染 KCNQ2 的中国仓鼠卵巢细胞 KCNQ2 通道电流图，去极化电压从-90 毫伏到+50 毫伏，每 10 毫伏递增。（B）10 μM 瑞替加滨作用的电流图。（C）去极化到-10 毫伏瑞替加滨的电流图。(D) G-V 曲线。
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第 2 章 自由活动大鼠海马神经元放电活动采集

多通道在体记录是细胞外记录，将电极置入神经元的表面，对神经元的活性进行检测。电极插入涉及手术过程，电极附近同时存在多个神经元的活动，单个电极可以同时记录到多个神经元的放电活动，而多电极的插入就可以获得大量神经元的活动，与此同时，一个神经元的特征也可被多根电极同时记录，因此，需要通过对电极记录到的电信号进行分析和甄别，并在这个基础上将不同神经元的放电活动区分开来。

2.1 实验材料
2.1.1 实验动物
清洁级雄性 SD 大鼠，体重为 250-350g，由上海斯莱克实验动物有限公司提供。动物饲养于清洁级大鼠饲养间，自由进水饮食，12 小时白天黑夜循环光照，温度控制在 19-24°C，湿度为 50%-60%。大鼠得到人为关怀使其适应研究人员触摸。所有动物福利与实验过程经动物保健机构与中国科学院上海药物研究所批准。
2.1.2 主要药品与试剂
戊巴比妥钠盐 北京鼎国公司
聚维酮碘 国药化学试剂有限公司
琼脂粉 Ameresco
牙托水泥 Vertex dental
氨卞青霉素 国药化学试剂有限公司
多聚甲醛 国药化学试剂有限公司
蔗糖 Sigma
氯化钠 国药化学试剂有限公司
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2.2 实验方法
2.2.1 在体多通道系统建立
本研究引入美国 Plexon 公司的多通道电生理在体记录系统，该系统可用于神经元网络编码机制的研究与分析，并可实时记录动物大脑群体神经元放电活动。电生理记录与分析系统主要部件如图 2-1 所示。将植入电极的自由活动大鼠脑部探头连接前置放大器，电信号放大后传入 Recorder 数据采集系统，电脑实时记录，通过 Offline Sorter V3 和 NeuroExplorer 4 软件离线分析（图 2-2）。

2.2.2 大鼠海马手术植入
电极大鼠腹腔注射 3% 戊巴比妥钠（0.2ml/100g）麻醉后，将大鼠头部固定于脑立体定位仪上，剪去头顶部的毛发，暴露皮肤，聚维酮碘消毒表面皮肤，酒精棉球擦示，在头部用刀片切出一个头尾部分 5 cm 左右的切口，暴露颅骨。用立体定位仪定位十字缝前囟(bregma) 点，参照 paxinos and watson 所著的《大鼠脑立体定位图谱》，对海马CA1区域进行定位：bregma向后 2.2-4.5 mm，旁开1.8-3.6mm，深度 2.0-3.2 mm。具体确定海马手术电极的位置并做标记(bregma 向后 4.2mm，旁开 2.2 mm， 深度 2.2 mm)。颅钻在头顶部打 4 个孔 (直径为 1 mm) ，装上颅骨螺丝钉，用于固定参考电极，换小钻 (直径为 0.6 mm) 打孔做为参考电极植入处。标记电极位置，用颅钻开 1 mm*1 mm 的窗口，除去颅骨，挑破硬脑膜，将电极插入此窗口(图 2-3)。所用电极为 2*4 电极阵列，电极表层为绝缘层，外表涂有石蜡，内部镍铬合金缠绕而成，电极尖端直径 35 um，长度 1.5 mm，电极间隔 300 um，阻抗小于 1 MΩ。用微推进器将电极下到指定深度，琼脂粉闭合电极手术野，牙托水泥固定电极于大鼠颅骨。手术后大鼠腹腔注射 10% 氨卞青霉素（0.2ml/100g）防止感染。动物单笼饲养，常规护理，恢复 7 天。
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第 3 章 瑞替加滨对大鼠海马神经元放电的影响 ............................................16
3.1 实验材料 ..........................................16
3.1.1 实验动物 ........................................................16
3.1.2 主要药品与试剂 ..........................................16
3.1.3 主要仪器设备与软件 ..............................................16
3.2 实验方法 .............................................16
3.2.1 大鼠海马手术植入电极 ..............................................16
3.2.2 在体电生理记录 ....................................17
3.2.3 数据分析 ............................................17
3.3 结果 ...........................................17
3.3.1 自由活动大鼠神经元自发放电随记录时间的变化 ........................17
3.3.2 瑞替加滨对海马神经元放电的影响 ........................................18
3.4 小结 .................................................24

第 4 章 瑞替加滨对 4-AP 和 XE991 诱导海马神经元痫性放电的影响

4-AP 是一种钾离子通道抑制剂，常被用来诱导痫性放电。在海马切片中，瑞替加滨 20 μM 显著性的减少 4-AP 所致海马癫痫样放电（40.9±24.5%），50 μM几乎完全阻止 4-AP 导致的异常放电，而其余常见的抗癫痫药物如卡马西平等对癫痫样放电不敏感[36]。XE991 为 KCNQ 抑制剂，也能引起神经元异常放电。在体外瑞替加滨能反转 XE991 所致的痫样放电，在膀胱组织中瑞替加滨能反转XE991 导致的张力增加[63]。给予 4-AP 或 XE991 大鼠可出现惊厥状态，表现为全身强直[38]。然而这些研究只局限于体外实验，我们采用多通道在体记录研究瑞替加滨在体内对上述两种药物诱导的癫痫样放电频率的影响。

4.1 实验材料
4.1.1 实验动物
清洁级雄性 SD 大鼠 4 只，体重为 250-350g，随机分为两组，4-AP 给药组 2只与 XE991 给药组 2 只，其余饲养条件和福利与 2.1.1 相同。
4.1.2 主要药品与试剂
瑞替加滨 南发俊课题组合成
4-AP 南发俊课题组合成
XE991 Sigma
其余药品与试剂与2.1.2 相同
4.1.3 主要仪器设备与软件
与 3.1.3 相同
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第 5 章 结论与展望

5.1 结论
本研究首先建立了一套在体多通道记录技术，实现了对自由活动大鼠海马CA1 区的电活动的监测和记录，所监测信号包括在体放电模式和场电位基本特征等。运用这个系统，我们首先将海马神经元进行了分类，进而考察了钾通道激动剂瑞替加滨对这些不同类型神经元放电的影响。我们发现瑞替加滨对海马锥体神经元与中间神经元的自发放电均有抑制作用。此外，我们的工作显示瑞替加滨可对抗钾离子通道抑制剂 4-AP 或 XE991 导致的海马神经元兴奋性升高。我们的研究工作首次运用在体记录方式在自由活动动物中研究抗癫痫药物瑞替加滨对神经兴奋性的影响，部分揭示了瑞替加滨治疗癫痫的作用机制。

5.2 进一步工作的方向
本文的研究工作首次揭示了瑞替加滨在体内对海马神经元放电的影响，虽然取得了初步的成果，但仍有许多问题有待深入研究，在实验方法上也有提升的空间。
首先，本工作主要集中在瑞替加滨对海马核团电活动的影响。癫痫在发作前即可能在结构上有病理改变，如神经退行性变化、树突可塑性、轴突发芽、神经再生、神经胶质细胞增生及血脑屏障损伤等，这些病理改变可能存在于癫痫脑区某一特定病灶区，也可能是与其相关的其它核团，在体电生理记录尚无法考察这些病理变化对神经电活动的影响[64]。目前，从整体水平上观察完整脑区形态学的研究进展缓慢，而在抗癫痫药物筛选中癫痫发作前后神经通路的病理学变化研究更是鲜少报道。因此，将在体电生理记录与一种高效快速的整体形态学研究方法相结合非常必要，这对癫痫发病机制的阐明以及抗癫痫药物的药理研究都具有重要意义。目前我们实验正在尝试将显微光学切片断层成像技术与在体电生理记录联合应用抗癫痫药物机制的研究。
第二，本研究目前是在正常大鼠上开展的，虽然钾通道抑制剂4-AP与XE991能在短时间内引起癫痫样的放电，但是与慢性癫痫模型大鼠的异常放电可能还是存在区别。因此下一步我们计划采用慢性癫痫大鼠模型研究瑞替加滨对疾病鼠神经元兴奋性的影响。
第三，已报道的具有抗癫痫效应的 KCNQ 钾通道激动剂有多个，目前我们主要研究的是瑞替加滨，对其它结构类型化合物的研究可以帮助我们更全面的了解 KCNQ 钾通道激动对神经元兴奋性的影响，有助于抗癫痫药物研发。
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参考文献（略）