Sirtl对内脏脂肪细胞定向分化的作用和机制研究

1前言

肥胖是因脂质代谢及脂肪分化异常，导致体内脂质过度沉积所引起的一种代谢性疾病，随着生活水平的提高及生活方式的转变，肥胖己日益成为突出的全球性健康问题⑴。近40年间，美国肥胖人群由13%升至30%左右；而我国成年人群中，约2亿人超重，其中肥胖症患者达6000多万[2]。根据脂肪沉积部位的不同，可分为内脏型肥胖和外周型肥胖：内脏型肥胖表现为大网膜、肾周等内脏脂肪库中脂肪过量沉积，而外周性肥胖则表现为脂肪在臀部及大腿等皮下脂肪库中大量累积[3]。大量研究证实，肥胖不仅与糖尿病、多囊卵巢综合征等代谢性疾病密切相关，而且也是高血压、冠心病等心血管疾病以及结肠癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤发病的高危因素[4]；并且，近年来的研究显示，与外周型肥胖比较，内脏脂肪的过量积聚与代谢、心血管疾病的发生发展关系更为密切[5]，其机制并不十分清楚，可能与内脏及皮下脂肪生物学特性存在差异有关[6]。因此，深入揭示内脏脂肪分化与功能的调控机制，寻求内脏型肥胖防治的新祀点日益成为肥胖研究领域的热点问题。
基于白色脂肪库中脂肪细胞分化及脂质代谢异常是引起肥胖最直接的原因，长期以来，众多学者以白色脂肪为对象，进行了大量的研究。近年来研究显示，在成人体内，还存在以产热耗能为主的产热型脂肪（棕色/米色脂肪）[7]。这种产热型脂肪高表达线粒体解偶联蛋白UCP1，可通过诱导解偶联呼吸显著抑制能量储存，使摄入的能量主要以热能的形式消散，发挥产热的效应从而对抗肥胖及其相关性疾病[8]。资料表明，棕色脂肪与白色脂肪具有不同的起源：棕色脂肪起源于Myf5阳性的前体细胞（骨豁肌/棕色脂肪细胞前体），这些前体细胞在不同诱导条件下可分别向骨豁肌或者掠色脂肪分化[9]；而白色脂肪则主要由白色脂肪库中Myf5阴性的前体细胞分化而来。有趣的是，白色脂肪库中存在的一些Myf5阴性细胞虽然UCPl的基础表达水平较低，但在特定的诱导条件下，例如冷刺激、cAMP处理后，UCP1的蛋白表达水平可迅速升高至经典的棕色脂肪水平，产热效应显著增加[10]。由于这些诱导产生的“棕色脂肪”在形态与功能上介于白色与棕色脂肪之间，因此又被称为“米色脂肪”；进一步的研究发现，米色脂肪拥有特异性的分子标记TMEM26和CD137[i2]。由于产热脂肪具有显著的燃烧脂肪、抑制脂肪沉积作用，因此关于产热脂肪形成的调控机制近年来迅速引起众多学者的关注。
PR结构域蛋白16 (PR domain-containing 16，PRDM16)基因是在研究人类白血病发病机制的过程中发现的，定位于1号染色体（lp36.3)。PRDM16编码1257个氨基酸[13]。除了 DNA结合锌指结构域、脯氨酸结构域、阻遏物结构域外，在N端83-215氣基酸处含有与SET结构域高度同源的PR结构域[14]。近年来的资料表明，PRDM16基因是棕色/米色脂肪分化的决定性基因，也是产热程序启动的"开关基因”，可以诱导多种前体细胞向棕色/米色脂肪分化，发挥产热耗能的作用[15]。PRDM16基因经选择性剪切后可产生两种主要的异构体，全长PRDM16与PR结构域缺失的SPRDM16;研究发现，在急性髓性白血病的发病过程中，两种异构体功能存在差异，在p53表达缺失的情况下，SPRDM16过表达可诱导白血病的发生，而PRDM16在其中的作用则具有明显的组织选择性[16]，然迄今为止，两种异构体在棕色/米色脂肪形成中的作用是否存在差异并不清楚。
Sirtuin-l(Sirtl)基因是一种NAD+依赖的组蛋白去乙酰化酶SIR2家族成员，能够促进组蛋白去乙酰化，在细胞能量代谢和氧化还原中发挥重要作用[17]。研究表明，Sirtl具有抑制肥胖，降低血糖的作用，其机制十分复杂，涉及对能量代谢中枢及外周脂肪组织等紀器官的调控[18]。即往研究主要集中在Sirtl对以储能为主的白色脂肪分化成熟及能量代谢的调控方面，研究发现Sirtl可抑制白色脂肪前体向白色脂肪分化，从而抑制白色脂肪组织中脂质积聚，减轻体重[19]。最新的资料表明，Sirtl可通过促进过氧化物酶体增殖激活受体PPAR-Y去乙醜化，进而招募PRDM16引起皮下白色脂肪的“掠色/米色化”，从而启动皮下白色脂肪的产热程序，解偶联呼吸增加，促进能量消耗及产热[20]。有趣的是，尽管Sirtl过表达可通过促进PPAR-Y去乙酷化招募PRDM16,诱导小鼠皮下白色脂肪“米色化”，但其内脏脂肪中并没有出现明显的米色脂肪，提示Sirtl对内脏与皮下脂肪的分化调控亦存在差别[2*^但Sirtl对内脏脂肪前体细胞定向分化到底发挥何种作用目前亦未阐明。
白黎戶醇是已知最强的天然Sirtl激动剂，但由于化学性质不稳定，生物利用度差，且常出现“脱紀效应"，从而限制了其在临床应用[21]。（E)-3，5，4’-三甲氧基-1, 2-二苯乙稀-间-3，5，4’-白黎戶醇，BTM-0512是合成的白藜戸醇甲基化衍生物，具有显著的Sirtl激动作用，临床前药代动力学研究发现其稳定性及脂溶性显著提高，生物利用度增加[22];我们课题组及其他学者研究发现，BTM-0512在内皮细胞衰老、胃淸病及肿瘤等方面具有广泛的生物学作用，但其在肥胖中的作用未见报道。
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2材料与方法

2.1试剂与仪器
2.1.1主要试剂
Tween-20 (吐温-20) Amresco 公司，美国
Glycin (甘氨酸） Amresco公司，美国
TEMED (四甲基乙二胺） Amresco公司，美国
SDS (十二烧基硫酸钠） Amresco公司，美国
APS (过硫酸钱） Amresco公司，美国
Acrylamide (丙炼酰胺〉 Amresco公司，美国
N，N’-亚甲基双丙稀醜胺 Amresco公司，美国
TrisC三经甲基氨基甲烧） Sigma公司，美国
PVDF膜（聚偏二氟乙稀膜） MUlpore公司，美国
Trizol RNA提取试剂 TAKARA公司，日本
RrimeScript逆转录试剂盒 TAKARA公司，日本
SYBR Real-time试剂盒 TAKARA公司，日本
PRDM16兔源多克隆一抗 Abeam公司，美国
Sirtl兔源多克隆一抗 Abeam公司，美国
彩色预染蛋白 Maker 碧云天生物技术研究所，江苏
CD34小鼠源单克隆一抗 Abeam公司，美国
CD44小鼠源单克隆一抗 Abeam公司，美国
HLA-DR小鼠源单克隆一抗 Abeam公司，美国
兔抗鼠FITC Abeam公司，美国
Western及IP细胞裂解液 碧云天生物技术研究所，江苏
BCA蛋白浓度测定试剂盒 碧云天生物技术研究所，江苏
PMSF (苯甲基横酷氟） 碧云天生物技术研究所，江苏
5XSDS-蛋白上样缓冲液 碧云天生物技术研究所，江苏
Westem-blot 一抗稀释液 碧云天生物技术研究所，江苏
Westem-blot 二抗稀释液 碧云天生物技术研究所，江苏
人PRDM16引物 生工技术服务有限公司，上海
人Sirtl引物 生工技术服务有限公司，上海
人UCP1引物 生工技术服务有限公司，上海
人C/EBPP引物 生工技术服务有限公司，上海
人Resistin引物 生工技术服务有限公司，上海
小鼠PRDM16引物 生工技术服务有限公司，上海
小鼠Sirtl引物 生工技术服务有限公司，上海
小鼠UCP1引物 生工技术服务有限公司，上海
小鼠C/EBPP引物 生工技术服务有限公司，上海
小鼠Resistin引物 生工技术服务有限公司，上海
小鼠TMEM16引物 生工技术服务有限公司，上海
PBS磷酸盐缓冲液 中杉金乔生物技术有限公司，北京
DMEM高糖培基 Hyclone公司，美国
胎牛血清 Hydone公司，美国
I型胶原酶 Gibco公司，美国
胰酶 Sigma公司，美国
猪胆盐 聚源生物有限公司，上海
胆固醇 鼎国生物有限公司，北京
3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX) Sigma公司，美国
地塞米松 Sigma公司，美国
胰岛素 Sigma公司，美国
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2.2方法
2.2.1人内脏脂肪组织的收集
收集腹部手术患者内脏脂肪，取手术样本前病人知情同意，由中南大学湘雅三医院提供。入选及排除标准如下-以体重指数（BMI=体重kg/身高m2) >25,作为超重/肥胖组；以体重指数在18.5-24.9之间为对照组；排除下丘脑、垂体疾病等引起的继发性肥胖；排除高脂血症、高血压、冠心病、心肌梗塞、脑血管意外、糖尿病、脂肪肝、多囊卵巢综合症、子宫内膜癌、骨关节炎、睡眠性呼吸暂停综合征、精神疾病、肥胖相关性肾病、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌等肥胖相关性疾病。
2.2.2人内脏脂肪SVF实验
2.2.2.1人内脏脂肪SVF分离、培养
根据上述入选及排除标准，选取对照组患者内脏脂肪组织，手术取材2小时内进行细胞培养，冰盒保存运输。
①取人内脏脂肪组织，剪成约Icm3大小；
②用PBS (0.01M, 4°C保存）洗漆2次，每次1分钟；
③用眼科剪将结缔组织剪除；
④剪碎脂肪组织，约Irrnn3大小；
⑤加入ImLI型胶原酶（PBS配制浓度为0.01M, -20°C保存)，37°C恒温水浴锅45 rpm震荡消化120分钟；
⑥收集消化液，2000 rpm离心10分钟；
⑦弃上清，加入细胞培养液（高糖DMEM培基含10%胎牛血清、1%双抗）吹打细胞沉淀，200目细胞蹄过滤；
⑧重悬细胞，种入6孔板，于37'C、体积分数为5%的C02饱和湿度条件下培养24小时；
⑨换培养基，洗去未贴壁细胞；
⑩细胞长至90%融合后用胰酶（0.25%，ImL) 37°C消化5分钟传代处理，至第三代。
2.2.2.2人内脏脂肪SVF流式细胞仪鉴定
取第3代SVF，吸去培养基，0.25%胰酶常规消化，制成1><109L_i的细胞悬液。鉴定标记为CD34、CD44、HLA-DR。
①取细胞悬液，2000 rpm离心10分钟；
②弃上清，PBS洗潘2次；
③加入ImLPBS重悬，分装成2(%L/管共4管，编号a、b、c、d;
④a管再加200tiLPBS，混匀，平均分成两管，一管为空白对照组，一管为FITC对照组；
⑤b-d 管为 CD34 组、CD44 组、HLA-DR 组；
⑥37°C孵育2小时，b-d管各加入CD34、CD44 HLA-DR单克隆抗体lO^iL;
⑦2000 rpm离心10分钟，弃上清，PBS洗漆2次；
⑧每管加入200fiLPBS，b-d管各加抗鼠FITC 二抗，避光1小时；
⑨上机检测。
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3.结果............................................ 15
3.1肥胖人群Sirtl与PRDM16的表达变化............................................ 15
3.2 Sirtl基因过表达抑制人内脏SVF向白色及产热脂肪分化............................................ 15
3.3 Sirtl激动剂对高脂诱导的实验性肥胖小鼠具有显著治疗作用............................................ 15
3.4 Sirtl激动剂对肥胖小鼠脂肪组织中脂肪分化相关基因表达的影响............................................16

4讨论

基于内脏型肥胖与代谢、心血管疾病密切相关，以及内脏脂肪细胞分化异常是引起肥胖的重要原因，本研究以内脏脂肪的分化调控作为切入点，揭示长寿基因Sirtl调节代谢的新机制，并进一步探讨Sirtl激动剂白藜声醇及其甲基化衍生物BTM-0512对高脂诱导实验性肥胖小鼠的治疗作用，发现：（1)肥胖人群内脏脂肪组织中Sirtl与总PRDM16的表达下降；（2) Sirtl基因过表达可同时抑制内脏脂肪基质血管成分SVF向白色及产热脂肪分化，伴随全长PRDM16表达水平降低；（3) Sirtl激动剂白藜戶醇及其甲基化衍生物BTM-0512可减轻高脂诱导肥胖小鼠体脂及内脏脂肪沉积，降低血糖血脂，且BTM-0512的作用优于白藜卢醇；（4) Sirtl激动剂同样抑制肥胖小鼠内脏脂肪中白色及产热脂肪分化相关基因的表达，降低全长PRDM16，上调总PRDM16水平；（5) Sirtl激动剂处理后，肥胖小鼠棕色脂肪中UCP1、全长PRDM16与总PRDM16的表达皆升高。上述研究结果为深入揭示Sirtl对内脏脂肪分化的调控作用及机制提供了新的线索。
目前，有关Sirtl基因对代谢的调节作用己有大量文献报道。现已阐明Sirtl具有潜在的抗肥胖作用[23，24]，然其机制十分复杂，涉及对中枢摄食行为及外周糖脂代谢的调节等[18]。有关Sirtl对脂肪细胞的影响，既往研究主要侧重于白色脂肪分化和功能调控方面；比如，文献报道Sirtl能够抑制白色脂肪细胞分化，降低血糖血脂，改善代谢[17],并且，Sirtl激动剂白藜卢醇还可以诱导3T3-L1白色脂肪前体细胞凋亡[25]。我们的研究亦证实，无论是在CD44阳性表达，具有千细胞样多向分化潜能的内脏脂肪SVF，还是在高脂饲养的肥胖小鼠，Sirtl可显著抑制细胞内脂质沉积，并可降低与胰岛素抵抗密切相关的脂肪细胞因子抵抗素Resistin的表达，提示Sirtl可抑制内脏SVF向白色脂肪分化，改善胰岛素抵抗。
近年来研究发现，成人体内除了以储能为主的白色脂肪外，还存在以产热耗能为主的棕色脂肪/米色脂肪，在寒冷刺激、cAMP、P肾上腺素能受体激动剂等诱导下，解偶联蛋白UCP1表达显著上调，解偶联呼吸加强，发挥抑制肥胖的作用[11]。虽然棕色脂肪与米色脂肪统称为产热脂肪，生物学功能极为相似，但二者也存在一些差异：比如，棕色脂肪主要来源于Myf5阳性的骨豁肌前体[9]，而米色脂肪则来源于Myf5阴性的白色脂肪前体，特征性表达CD137、TMEM16等[12]。不过资料显示，无论是棕色还是米色脂肪，其分化皆受PR结构域蛋白16 (PRdomain-containing 16, PRDM16)的调控，PRDM16过表达可诱导骨豁肌和白色脂肪前体分别向棕色和米色脂肪分化[26，27]。2012年，Cell杂志报道，Sirtl过表达可募集PRDM16形成PRDM16 / PPAR-y转录复合体，诱导小鼠皮下白色脂肪“米色化"及棕色脂肪分化，但在内脏白色脂肪中并没有出现明显的“米色脂肪”[21]。相似的，我们发现Sirtl激动剂白藜卢醇和BTM-0512可上调掠色脂肪中UCP1的表达；然而，无论是Sirtl激动剂处理肥胖小鼠或是Sirtl过表达质粒转染内脏脂肪SVF，都可引起内脏脂肪中与产热脂肪分化相关的基因UCP1、C/EBPp、TMEM16表达下调。
产生这种脂肪分化调控组织特异性的原因并不十分清楚，可能与各部位脂肪组织的来源及基因表达存在差异有关。我们在研究中，发现Sirtl对PRDM16两种主要选择性剪切异构体（全长PRDM16与SPRDM16)的表达调控也存在组织差异。在肩胛部位的棕色脂肪组织，Sirtl激动剂可显著上调全长PRI)M16与总PRDM16 (全长PRDM16+SPRDM16)的表达，而在内脏脂肪组织，Sirtl激动剂处理后，尽管总PRDM16表达水平增加，但全长PRDM16的表达却受到明显抑制。同样，在Sirtl过表达的内脏脂肪SVF,在总PRDM16表达无显著差异的情况下，全长PRDM16表达显著下调。上述研究提示，Sirtl过表达可引起全长PRDM16/总PRDM16 (或者也可视为PRDM16/sPRDM16)的比例显著下降，而这种变化可能是Sirtl不能诱导内脏脂肪出现“米色化”的重要原因，但其机制有待进一步实验验证。
有意思的是，我们发现在Sirtl低表达的情况下，全长PRDM16与总PRDM16的变化并不出现明显的规律性：例如，无论是肥胖人群还是高脂饲养的肥胖小鼠，尽管内脏脂肪组织中Sirtl表达都降低，但肥胖人群总PRDM16蛋白与mRNA表达水平降低，全长PRDM16 mRNA无变化，而在肥胖小鼠，全长PRDM16mRNA降低（p<0.05)，总PRDM16则呈降低趋势（p=0.059)。推测其原因，除了与人鼠种属差异，肥胖发病机制及病程不同等多种原因有关外，可能还涉及Sirtl对干细胞生物学行为的调控。文献报道，Sirtl是维持骨髓与脂肪来源的间充质干细胞长期生长的一种不可或缺的调控因子，Sirtl基因的RNA千扰可减慢干细胞生长的速度并促进其衰老[29]。因此，肥胖者由于内脏脂肪中Sirtl表达降低，可能会引起脂肪干细胞失去正常的生长分化潜能，从而导致生物学功能的紊乱。
在本实验中，我们还观察到一些有意义的现象：（1)高脂诱导的实验性肥胖治疗中，白藜，醇甲基化衍生物BTM-0512的作用比白藜卢醇更为突出，推测可能与BTM-0512克服了白藜产醇化学性质不稳定，脂溶性差，生物利用度低等缺点有关，但其临床前景如何尚需大量研究进行综合评价；（2)在高脂诱导肥胖小鼠的棕色脂肪中，与正常饮食的对照组相比，无论是全长还是总PRDM16的表达均没有明显变化，提示高脂诱导的肥胖模型其发病机制可能并不涉及棕色脂肪活性降低，主要还是与白色脂肪分化异常有关，这也部分解释了尽管Sirtl过表达抑制内脏脂肪前体向米色脂肪分化，却仍可显著降低内脏脂肪含量的现象，究其原因可能与Sirtl抑制白色脂肪分化有关。
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5结论

(1) Sirtl基因过表达可同时抑制内脏脂肪前体向白色及米色脂肪分化；
(2) Sirtl抑制内脏脂肪前体"米色化”的机制可能与降低全长PRDM16表达水平有关；
(3)在髙脂诱导的肥胖小鼠，甲基化白藜声醇衍生物BTM-0512显著上调Sirtl表达，降低血糖、血脂、体重及抑制内脏白色脂肪沉积。
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参考文献（略）