重组灵芝免疫调节蛋白对骨质疏松大鼠的保护作用及机制研究

第 1 章 绪论

1.1 骨质疏松症的研究进展
1.1.1 骨质疏松概况
“骨质疏松（osteoporosis，OP）”一词是由欧洲的病理学家 Pommer 于 1885年首次提出，意为一种骨质减少的疾病；Albright 在 1948 年指出该病是一种蛋白质的代谢出现异常、骨小梁的形成减少的疾病；而后 Sissions 又对 OP 做了进一步的补充，明确 OP 是骨含量减少、骨组织内部结构发生改变的疾病[1]。直至二十世纪九十年代的国际骨质疏松研讨会，“骨质疏松”才被明确定义并被世界公认[2]：OP 是一种全身退行性的、代谢性骨骼系统疾病，其主要特征为骨矿物质含量的减少、骨组织内部结构的退化（即骨小梁变细，甚至发生断裂）、骨的生物力学强度的降低等，该病的发生常伴有骨折的风险，尤其以腰椎、股骨等部位最为常见[3-5]。
OP 的临床表现为：全身骨痛、易骨折、呼吸系统障碍、身高变矮、驼背等。根据 OP 的病因，可将其分为以下三大类：即原发性骨质疏松、继发性骨质疏松和特发性骨质疏松。原发性骨质疏松又分为老年性骨质疏松和绝经后骨质疏松，二者只与年龄的老化、性腺功能的降低相关，尤其是雌激素水平的降低。
绝经后骨质疏松（postmenopausal osteoporosis，POP），即女性绝经后，由于性腺功能的衰退，导致雌激素的分泌减少，使得骨的吸收超过了骨的形成，导致骨量减少，最终引发 OP。
老年性骨质疏松，顾名思义是随着年龄的增长，骨的内部结构发生退化，骨量减少，使骨的脆性增加，从而更易发生骨折。
继发性骨质疏松则是由某些药物或者疾病引发，例如药物的应用、红斑狼疮、钙的缺乏症、维生素 C 缺乏症、维生素 D 缺乏症、内分泌紊乱等[6,7]。早在二十世纪三十年代，Cushing 等[8]就对糖皮质激素性骨质疏松（glucocorticoid-inducedosteoporosis，GIOP）进行了详细的描述，时至今日 GIOP 已成为最常见的继发性骨质疏松症[8-10]。
特发性骨质疏松与遗传因素有关，不过其具体的发病原因尚不明确。
1.1.2 糖皮质激素性骨质疏松
糖皮质激素（glucocorticoid，GCs）由肾上腺皮质中的束状带合成、分泌，以甾核为其基本结构。正常生理剂量下的 GCs 主要影响基本生命物质的代谢，超过生理剂量后 GCs 具备抗免疫、抗休克、抗炎等作用[11,12]。因此，GCs 被广泛用于治疗多种疾病[13]，如过敏性疾病、炎症或重度感染、自身免疫病或内分泌不足[10]、呼吸系统疾病[14]以及血液病等。然而长期使用 GCs 会对身体产生多种损害，其中骨质减少、OP 和骨折均为众所周知的严重后果[15-17]。
GCs 可对骨代谢产生深远的影响，其引发 GIOP 的作用机制主要表现为两个方面[18,19]，一方面是 GCs 可以抑制成骨细胞（Osteoblast，OB）的复制，减少其前体细胞的分泌与形成，诱导 OB 的凋亡[19-21]，从而延迟骨的形成，破坏骨吸收与骨形成的平衡，造成骨丢失[22]；另一方面，GCs 可直接的刺激破骨细胞（Osteoclast，OC）[9]，并拮抗 1,25-(OH)2D3对小肠的作用，抑制肠道对钙的重吸收作用，使血 Ca2+降低，甲状旁腺素（Parathyroid hormone，PTH）升高，进而刺激骨的转换作用，最终导致 OP[23]。并且如图 1.1[24]所示，GCs 还可影响神经内分泌系统（Neuroendocrine system）和肌肉组织。对于神经内分泌系统，GCs通过抑制生长激素（Growth hormone，GH）和胰岛素样生长因子 I（Insulin-likegrowth factor-I，IGF-I）的分泌，削弱骨的形成作用；通过降低机体对性激素的分泌，而促进骨的吸收作用。GCs 还可以诱导肌肉中的肌原纤维水解，而引发肌无力症，增加骨折风险。

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1.2 动物模型的选择与建立
为研究防治 O P 的药物疗效，目前复制 OP 动物模型的方法有很多种[60]，以去卵巢[61]、注射 GCs[62]和灌胃维甲酸[63]3 种方法为主。而选择适当的实验动物和建立理想的动物模型是确保实验的准确性、可靠性的前提。
大鼠一直是最常用的模型动物，在 OP 的研究中也不例外[64,65]，其优点为：与人类的骨骼系统极其相似；可在较长的时间里维持全身骨量稳定；造模因素相对单一且重复性好；发生 OP 后，对药物疗效的反应与人类相近；具有明显的年龄界限，对观察年龄和骨骼的关系有利；价格低廉，易于饲养且繁殖快。
去卵巢模型，即对适龄的雌性大鼠进行无菌手术，切除其双侧卵巢。手术后，大鼠的骨代谢活跃，最短两周即可出现骨量丢失、骨强度降低等现象。此模型是由Saville于1969年首先建立的，现在已成为公认的绝经后骨质疏松症的经典模型[66]。然而由于手术对模型动物的创伤相对大，因此要求模型动物必须具有强大的抗感染和生存能力。
维甲酸，属维生素A衍生物，常用于治疗皮肤、肿瘤等疾病，治疗过程中伴有诱发OP的副作用[64]。因此邵金鸾[67]等人于1989年首次利用维甲酸的这一副作用，成功复制出急性的继发性OP动物模型。相比于去卵巢模型，维甲酸模型对模型动物的创伤小、且造模时间短，但存在的影响因素过多。
注射GCs模型的造模周期亦短，且成功率高、OP表现典型。与此同时，由于GCs在临床上的应用广泛，它已成为继雌激素缺乏、老年因素之后，导致OP的第三大原因，因此注射GCs模型对研究继发性的OP具有深远意义。
在注射GCs的模型中，常用的GCs有波尼松、氢化可的松、地塞米松（Dexamethasone，DEX）等，该模型可以通过肌肉注射、皮下注射、灌胃、埋植等方法建立。其中灌胃给药的操作相对困难，造模时间也相对长；皮下注射或埋植给药的吸收效果不理想，且成本较高。所以，以肌肉注射DEX的大鼠模型最为常用，研究表明一般5至6周即可成功建立模型[66]。另外，有研究表明大剂量GCs可降低大鼠的抵抗能力，造成大鼠的死亡。因此，本研究以Wistar大鼠为模型动物，采用肌肉注射中剂量的DEX的方法，复制GIOP动物模型，模拟由GCs药物所致的继发性OP，以期为研发防治OP的药物提供重要实验数据。
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第 2 章 材料和方法

2.1 实验材料
2.1.1 实验动物
健康灵活 Wistar 雌性大鼠，6 周龄，体重 180±20g，SPF 级。购于吉林大学基础动物中心，动物许可证编号：SCXK 京 2009-0004。
在吉林大学 SPF 级条件下饲养。将大鼠置于室温（20±2）℃，24 小时昼夜循环光照（于 8:00-20:00 给予光照，20:00-8:00 给予黑暗）条件下生活，使大鼠自由饮水、取食。
适应实验室环境 2 天后，选取合格的大鼠 60 只随机分为 6 组，每组 10 只。
2.1.2 药品和试剂
rLZ-8 吉林大学钻智基因工程药物研究所
地塞米松注射液 河南润弘制药股份有限公司
阿仑膦酸钠片 万特制药（海南）有限公司
兔抗大鼠 OPG 抗体 北京博奥森生物技术有限公司
兔抗大鼠 RANKL 抗体 北京博奥森生物技术有限公司
血清碱性磷酸酶测试盒 南京建成生物工程研究所
血清钙离子测试盒 南京建成生物工程研究所
血清无机磷测试盒 南京建成生物工程研究所
大鼠 IL-6 ELISA 检测测试盒 美国 R&D 公司
大鼠 TNF-α ELISA 检测测试盒 美国 R&D 公司
乙醇、生理盐水、水合氯醛、多聚甲醛、石蜡、二甲苯等均为分析纯试剂。
2.1.3 实验耗材
称量纸，一次性注射器，灌胃针，酒精棉，游标卡尺，锡纸，研钵，EP 管，试管，烧杯，量筒，移液管，移液枪，枪头，镊子，组织剪，止血钳，安瓿瓶，液氮，记号笔，秒表，鼠垫料，鼠维持料等。
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2.2 实验方法
2.2.1 地塞米松诱导的大鼠 OP 模型的建立
参考 Liu Meijie，Lucinda LM.等人[87,88]的方法，建立本实验 OP 动物模型，即对大鼠肌肉注射 DEX（2.5mg/kg），每周给药 2 次，连续给药 13 次，持续给药7 周。于最后一次给药后处死大鼠，并迅速取血、动物脏器组织以及骨组织，进行相关检测。观察大鼠的股骨骨矿物质含量、骨矿物质密度均降低，证明 OP 动物模型成功建立。
2.2.2 实验分组及给药方法
雌性大鼠 60 只随机分为 6 组，每组 10 只。
生理盐水组（saline）：day1-day48，于每天 8:00 及 16:00 腹腔注射生理盐水，每天 2 次。day4-day48，每周第 1、4 天肌肉注射给药生理盐水，一周 2 次。
模型组（Dexamethasone，Dex）：day1-day48，于每天上午 8:00 及 16:00 腹腔注射生理盐水，每天 2 次。day4-day48，每周第 1、4 天肌肉注射给药 DEX，2.5mg/kg 体重，连续给药 13 次，给药 7 周。
阳性药组（Dex+Alendronate 1mg/kg）：day1-day48，于每天灌胃给药阿仑膦酸钠，1mg/kg 体重，每天 1 次。day4-day48，每周第 1、4 天肌肉注射给药 DEX，2.5mg/kg 体重，连续给药 13 次，给药 7 周。
rLZ-8 低剂量组（Dex+rLZ-8 28μg/kg）：day1-day48，于每天 8:00 及 16:00腹腔注射 28μg/kg 体重的 rLZ-8，每天 2 次。day4-day48，于每周第 1、4 天肌肉注射给药 DEX，2.5mg/kg 体重，连续给药 13 次，给药 7 周。
rLZ-8 中剂量组（Dex+rLZ-8 56μg/kg）：day1-day48，于每天 8:00 及 16:00腹腔注射 56μg/kg 体重的 rLZ-8，每天 2 次。day4-day48，于每周第 1、4 天肌肉注射给药 DEX，2.5mg/kg 体重，连续给药 13 次，给药 7 周。
rLZ-8 高剂量组（Dex+rLZ-8 112μg/kg）：day1-day48，于每天 8:00 及 16:00腹腔注射 112μg/kg 体重的 rLZ-8，每天 2 次。day4-day48，于每周第 1、4 天肌肉注射给药 DEX，2.5mg/kg 体重，连续给药 13 次，给药 7 周。
2.2.3 观察指标
2.2.3.1 大鼠体重
每天对大鼠进行称量并记录体重数据。
2.2.3.2 体征观察
于每天上午、下午分别观察一次大鼠的状态，包括毛色、进食状况等，并记录结果。
2.2.3.3 样本制备
于实验第 49 天，对各组大鼠采用腹腔注射 10%水合氯醛（3.0ml/kg）的方式，使大鼠进入深度麻醉，而后腹主动脉取血，离心后得到血清待测；迅速分离大鼠双侧股骨，用生理盐水冲洗分离出的骨组织至无血液残留后，将左股骨上1/3 段骨组织进行适当修整，并浸泡于 4％的甲醛溶液中。将剩余骨组织称重并记录后，先用生理盐水浸泡过的纱布包裹，再用锡纸包裹，于-80℃保存。最后小心取出大鼠的心、肝、脾、肺、肾、胸腺，进行精确称重并记录实验数据。
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第 3 章 实验结果 ...................................................18
3.1 各组大鼠体重变化测定结果 ........................................................18
3.2 各组大鼠体征变化观察结果 ........................................................18
3.3 大鼠骨组织各项指标测定结果 ....................................................19
3.3.1 大鼠右股骨参数测定结果.......................................................19
3.3.2 骨密度测定结果.......................................................................21
3.3.2.1 大鼠右股骨矿物质含量测定结果.....................................21
3.3.2.2 大鼠右股骨矿物质密度测定结果.....................................22
3.3.3 光镜观察 HE 染色结果 ...........................................................23
3.3.4 大鼠骨组织 OPG/RANKL 蛋白表达测定结果......................24
3.4 大鼠血清生化指标测定结果 ........................................................26
3.4.1 Ca2+含量测定结果.....................................................................26
3.4.2 P 含量测定结果 ........................................................................27
3.4.3 ALP 活力测定结果 ...................................................................28
3.4.4 IL-6 含量测定结果....................................................................29
3.4.5 TNF-α 含量测定结果................................................................29
3.5 大鼠各脏器系数测定结果 ............................................................30

第 4 章 结果分析与讨论

本实验以 rLZ-8 为研究对象，采用肌肉注射 DEX 的方法复制大鼠 GIOP 模型，并以阿仑膦酸钠作为阳性对照药物，首次系统的观察了 rLZ-8 低、中、高 3个剂量对 GIOP 的防治作用。实验结果显示 rLZ-8 对 GIOP 具有一定的保护作用，可有效改善 GIOP 大鼠的骨密度降低、骨代谢紊乱、骨小梁结构退化等现象，从而降低 GIOP 的发生。

4.1 毒副作用
大鼠体重的变化可以反映其应激反应的程度[89]。本实验开始后，各组大鼠体重均发生大幅变化，其中生理盐水组的大鼠体重整体呈缓慢增长的趋势，而其他各组大鼠体重虽然有时也存在上升，但却始终低于生理盐水组。模型组、阳性药组和 rLZ-8 低、中、高剂量组在实验第 4 天第一次给予 DEX 后，体重有明显的下降，分析可能由于 DEX 的刺激导致大鼠的进食、生理代谢等功能出现异常，在 DEX 给药结束后大鼠体重立即恢复注射前的正常增长，如此往复使得以上 5组大鼠的体重至实验结束均未有明显变化。在整个实验过程中，各组大鼠的体重均不存在显著性差异。
除此之外，本实验结果还显示，GIOP 发生后，rLZ-8 只在一定程度上拮抗了GIOP 大鼠肝脏、脾脏、肺脏的不良反应，而对于其他的脏器并无显著影响。
以上实验结果间接表明 rLZ-8 对 GIOP 大鼠本身无明显的毒副作用。

4.2 骨密度
BMD 由单位体积内的骨组织含量最大值和从最大值开始减少的速度共同决定，可高精确且稳定的反应骨的强度，也可间接评价骨量丢失的程度。因此，BMD 是评价抗 OP 药物的疗效的重要指标，它已成为目前判断 OP 模型是否成功建立的金标准[9,90]。本实验经 HH6005 型单光子骨矿物密度检测仪测定大鼠股骨质量，其实验结果显示，模型组中大鼠的 BMC 和 BMD 均显著下降，可证明本实验模型复制成功。而 rLZ-8 低、中、高剂量组中 BMC 和 BMD 相比与模型组显著升高，且具有一定剂量依赖性，同时 rLZ-8 的高剂量组的保护效果与阳性药相近。
以上实验结果说明 DEX 可导致 BMC、BMD 降低，骨吸收作用活跃；rLZ-8对 OP 有一定的保护效果，即 rLZ-8 对 GCs 导致的骨量减少有保护作用。

4.3 骨显微形态学
OP 的主要特征除了 BMC 减少、BMD 降低外，还有骨结构的退化。而骨小梁的数量、形态以及骨小梁之间的连接情况均可直接反应骨的强度和稳定性，因此观察骨显微结构的变化可以直接的反应 OP 情况[91]。
在骨重建的过程中，骨小梁的表面光滑，且各小梁紧密相连，形成网状的立体的空间结构，以此避免骨折的发生。而 OP 发生后，骨量丢失严重，使骨小梁数量减少、间距增宽、小梁变细；另外在骨吸收过程中，OC 不断降解骨小梁中的骨胶原和无机盐等，使得骨小梁表面的吸收陷窝增多、加深，导致骨小梁出现穿孔、断裂等现象。本实验结果显示，模型组大鼠的骨小梁结构被完全破坏，出现断裂，同时还伴随骨髓腔增大，腔内出现较大的空白的脂肪细胞区域，而阳性药组和 rLZ-8 低、中、高剂量组大鼠的骨小梁则呈现不同程度改善。提示 DEX可引发 OP，损坏骨小梁的结构；而 rLZ-8 对维持骨小梁的结构方面具有积极作用，同时也可抑制骨吸收作用，延缓骨量的丢失。
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第 5 章 结论

（1） 成功建立由 DEX 引发的 GIOP 大鼠模型；
（2） rLZ-8 对大鼠的体重和脏器系数无显著影响，间接表明 rLZ-8 无明显毒副作用；
（3） rLZ-8 干预能升高大鼠 BMC、BMD，表明 rLZ-8 能改善 GIOP 大鼠的骨量减少的现象；
（4） rLZ-8 对 GIOP 大鼠骨小梁的退行性损坏具有积极作用；
（5） rLZ-8 可以升高血清 Ca2+含量和血清 ALP 活性，降低血清 P 含量；提示 rLZ-8 能改善骨代谢紊乱；
（6） rLZ-8 干预能降低 GIOP 大鼠血清细胞因子 IL-6 和 TNF-α 的含量，表明 rLZ-8 可能通过抑制神经炎症反应对 OP 起保护作用；
（7） rLZ -8 可以改善 GCs 对 OPC 的作用，抑制 RANKL 的表达，同时促进 OPG 的表达，从而抑制骨吸收。
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参考文献（略）