Snail引发口腔癌细胞上皮组织转变和促进其取得肿瘤干细胞样特征的试验钻研

第一部分 pEGFP-N1-Snail

真核表白质粒的构建Snail 基因家族是引诱 EMT 发作的症结转录因子，编码具备锌指构造的转录因子，包含 Snail1 (Snail), Snail2 (Slug), Snail3 (Smuc)。Snail 为 Snail 家族的第一个成员，首先是在果蝇中发明的，同时在脊椎植物的胚层造成历程中施展主要作用[17]。作为 E-cadherin 的转录的克制因子[17, 18]，它能联合到 E-cadherin 的启动子，克制 E-cadherin 的表白，从而在胚胎发育和肿瘤转移历程中引诱 EMT 发作[13]。不只如此，Snail 还具备掩护干细胞功用，在肿瘤细胞中，异位表白 Snail能增添肿瘤细胞的克隆造成率，使肿瘤细胞更易在远处定植及表白肿瘤干细胞标志物[14]。本试验通过构建 pEGFP-N1-Snail 真核表白质粒，为下步钻研 Snail 引诱口腔癌细胞发作 EMT 及具备 CSC 样特征的作用机制奠定试验基本。

1 资料和方式

1.1 主要实验材料
1.1.1 实验细胞SCC9肿瘤上皮细胞，购自美国ATCC公司。
1.1.2 实验仪器及耗材恒温台式多用离心机(Thermo, USA)，超净工作台(Baker, USA)，细胞培养箱(Heraeus, Germany)，倒置相差显微镜(Olympus, Japan)，血细胞计数板（北京中显恒业仪器仪表有限公司），普通离心机(Thermo, USA)，高速冷冻离心机(HERAEUS, Germany)，基因扩增仪(Eppendorf, Germany)，琼脂糖凝胶电泳仪(Pharmacia, USA) ， PCR 成 像 仪 (Bio-Rad, Germany) ， 隔 水 式 恒 温 培 养 箱（GNP-9080BS-Ⅲ,上海新苗医疗器械制造有限公司），温控培养摇床（SCS-24，上海离心机械研究所有线公司），数显恒温水浴箱（金坛市荣华仪器厂），超纯水系统(PALL, USA)，高压灭菌锅(TSAOSHIN, USA)，电子天平(SHIMADZU,Japan)，FiveEasy pH计(METTLER TOLEDO, CH)，培养瓶(Corning, USA)，培养皿(Costar, USA)，EP管，PCR管常规耗材等。
1.1.3 实验试剂DMEM-F12 培养基(GIBCO, USA)，进口胎牛血清(FBS, GIBCO, USA)，0.25%胰蛋白酶(GIBCO, USA)，双抗(GIBCO, USA)，氢化可的松(Sigma, USA)，TRIzol(Invitrogen, USA)，DEPC (Sigma, USA)，逆转录试剂盒(TaKaRa, Japan)，琼脂凝胶(GENE TECH, CH)，Gold ViewTM核酸染料（上海赛百威基因技术有限公司），DNA 凝胶回收试剂盒(Omega, USA)，pMD18-T 载体(TaKaRa, Japan)，T4 DNA连接酶(TaKaRa, Japan)，大肠杆菌 DH5α 感受态细胞（南京医科大学口腔研究所提供），氨苄霉素(ATCC, USA)，2×YT 培养基（南京医科大学口腔研究所提供），Ex-Taq 酶(TaKaRa, Japan)，DNA marker DL2000 (TaKaRa, Japan)，Endo-freePlasmid Mini Kit Ⅱ质粒提取试剂盒(Omega, USA)，卡那霉素(ATCC, USA)，HindⅢ和 Bam HⅠ限制性内切酶(TaKaRa, Japan)，pEGFP-N1 载体（#U55762，南京医科大学口腔研究所提供），各种分析纯试剂等。

1.2 实验方法
1.2.1 SCC9细胞培养及传代SCC9 肿瘤上皮细胞株按 ATCC 官方要求培养于 DMEM-F12 完全培养液中（含 10% FBS，1% 双抗，400 ng/mL 氢化可的松），置于 37 ℃，5% CO2细胞培养箱中培养。待细胞生长融合达到 80-90%，用 0.25%胰蛋白酶消化后按 1: 3的比例传代培养。1.2.2 样本总 RNA 提取（1） 实验前准备：将要用到的 EP 管，PCR 管等可能接触到 RNA 的耗材置于0.1%的 DEPC 中浸泡 24 h 后，取出后高温高压灭菌，烘干备用。（2） 实验步骤：① 将培养好的细胞用 PBS 洗两遍，用胰蛋白酶消化，加入含血清培养基中和，离心，弃上清，加入 1mL TRIzol 置悬，移入 EP 管，室温放置 5 min；② 加入 0.2 mL 三氯甲烷，用力振摇 15 s，室温放置 10 min，待其分层。

第二部分 过表达Snail诱导口腔癌细胞上皮间质转化并促其获得高侵袭和转移能力的体外

研究由上皮细胞向间质细胞转分化的过程被称之为EMT，在胚胎的发育中起着重要作用。EMT的过程是描述形态学和分子学方面变化的过程，伴随着细胞上皮性状的丢失，间质性状的获得，细胞形态从铺路石样向成纤维样改变，同时细胞的侵袭和转移能力增强。这一过程的改变，由一系列转录因子调控，包括Snail，Slug，ZEB和Twist等[27]。越来越多的研究证实，EMT在肿瘤的侵袭和转移中起着重要作用。肿瘤细胞发生EMT后，细胞间粘附能力减弱，易离散，能离开原发灶后侵入到邻近组织，同时肿瘤细胞获得了较强的侵袭能力，突破内皮屏障进入到体循环，细胞能不依赖支持物在血液中存活，随着血液循环吸附到远处的血管后离开体循环，最后，在远处定植，肿瘤细胞能在新的环境中形成转移灶[28, 29]。然而，在口腔癌细胞SCC9中，Snail是否能诱导其发生EMT的研究较少见。因此，本实验通过体外增强Snail表达，使SCC9细胞过表达Snail，从而观察Snail这个转录抑制因子诱导口腔癌细胞发生EMT后使细胞获得高侵袭和转移能力的影响，进一步探讨Snail在口腔癌侵袭转移过程中的作用。
1 材料和方法
1.1 主要实验材料
1.1.1 实验细胞SCC9肿瘤上皮细胞，购自美国ATCC公司。
1.1.2 实验仪器及耗材恒温台式多用离心机(Thermo, USA)，超净工作台(Baker, USA)，细胞培养箱(Heraeus, Germany)，倒置相差显微镜(Olympus, Japan)，正置相差显微镜(Olympus, Japan)，血细胞计数板（北京中显恒业仪器仪表有限公司），普通离心机(Thermo, USA)，高速冷冻离心机(HERAEUS, Germany)，基因扩增仪(Eppendorf, Germany)，7300 ABI Real-time PCR仪(Applied Biosystems, USA)。

目录
第一部分 pEGFP-N1-Snail ......................7
1.1 材料和方法 ......................7
1.2 结果 ...................... 14
1.3 讨论 ...................... 19
1.4 结论 ......................21
第二部分过表达 Snail..................... 22
2.1 材料和方法 ...................... 22
2.2 结果 ......................30
2.3 讨论 ...................... 36
2.4 结论 ...................... 37
第三部分过表达 Snail 诱导口.................38
3.1 材料和方法...................... 38
3.2 结果 ...................... 40
3.3 讨论 ...................... 44

小结
口腔癌是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤，局部发和颈淋巴结转移是其致死的主要原因 。尽管口腔癌的治疗策略和治疗水平已有很大进步，但患者五年生存率多年来未见明显改善。肿瘤细胞发生局部浸润和远处转移是其顽固性和难治性的根本原因，然而，其发生机制尚未明确。近年来，EMT在恶性肿瘤侵袭转移过程中可能发挥关键作用受到广泛关注。研究发现Snail通过抑制E-cadherin表达在EMT过程中起核心调控作用，是其关键调节因子。

参考文献
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