1文献综述
1. 1 MAPK信号转导通路
1.1.1信号转导通路简介
细胞跨膜信号转导的一般步骤为：首先，细胞接受来自细胞外的各种生物刺激信号，即细胞外信号分子与祀细胞受体特异性的结合；然后，细胞通过一些特殊的蛋白质信息传递链将细胞外的各种刺激信号传递到细胞及其核内；最后，细胞内的效应蛋白被激活，并最终诱导产生一系列细胞质和细胞核内事件，以及各种各样的生理生化反应[2]。细胞外信号向细胞内传递过程如图1所示。这些蛋白质信息传递链通常被称为细胞信号转导通路。生物细胞内的信号转导具有严密的组织，并且高度网络化。
1.1.2 MAPK信号转导通路
丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路是生物体内转导细胞外信号到细胞内并诱导产生一系列细胞反应的一条重要的信号转导通路，处于分子信号转导网络的中心[3]。自从1991年细胞外信号调节激酶（Extrallular Signal Regulated Protein Kinase, ERK)被 Sturgill 等在哺乳动物中发现以来，MAPK 信号转导通路的研究在近二十年内取得了迅猛发展[4]。研究表明，MAPKs广泛存在于各种真核生物细胞中，并由一组以级联方式依次活化的丝氣酸/苏氨酸蛋白激酶组成。它是信号从细胞外逐级放大并转导到细胞及其核内的重要传递着，主要参与细胞分化、细胞增值、细胞调亡和胚胎发育等过程。人类许多疾病如炎症、癌症和免疫性疾病等的发生都与MAPKs表达量的异常有直接或间接关系[3]。MAPK信号通路主要由上游激活物，核心模件蛋白及下游效应蛋白组成。上游激活物包括众多能调节细胞生长、发育、分化、洞亡的蛋白质因子，如细胞因子、生长因子、激素、神经递质等，以及它们在细胞膜上的相应受体[5]。核心模件蛋白分别为丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶（MAPK kinase kinase，MKKK/MAP3K)，丝裂原活化蛋白激酶激酶（MAPK kinase, MKKyMAP2K)和丝裂原活化蛋白激酶（MAP kinase, MAPK)在哺乳动物细胞中，迄今已发现14种MAP3KS, 7种MAP2KS以及12种MAPKs。下游效应蛋白是指MAPKs的作用底物，主要包括转录因子、细胞质憐酸酶和蛋白激酶等。活化前的MAPKs主要位于细胞质中，活化后即迅速进入细胞核内激活祀基因[5]。当细胞感知到外界的刺激信号后，细胞主要通过高度保守的三级激酶级联反应方式来传递信号，并最终导致细胞出现相应的生物学反应，其中MAPK处于这种级联反应链的末端。MAPKs通过三级激酶级联反应方式传递信号的过程如图1.2所示。细胞外剌激通过某些环节首先激活MAP3K，转而MAP3K激活MAP2K，接着MAP2K激活后通过双位点磷酸化激活MAPK，接着转入核内。MAPK可以被认为是该信号通路的枢纽，被激活的? MAPK —方面可以磷酸化胞质内的粑蛋白，另一方面又能进入细胞核内作用于相应的转录因子，调控基因的表达，从而参与细胞的一系列生理病理过程，如细胞的生长、发育、调亡和恶变以及各细胞之间的功能同步等，并与肿瘤、炎症及其它多种疾病的产生密切相关。
1.1.3MAPK的家族成员及其特点
P38信号通路是MAPK家族中的一个重要分支，并被认为是细胞因子介导的免疫反应机制的一个重要部分。P38 MAPK能够被各种各样的细胞压力比如高渗透压、紫外线照射、机械应力等以及炎性细胞因子如肿瘤坏死因子和白细胞介素等激活，是宿主防御系统的一个关键过程[17]9]。目前研究认为p38的激活能够触发的各种生物学效应，包括细胞死亡、分化、增殖和衰老等特别是在促炎性细胞因子比如肿瘤坏死因子-(X (TNF-a)和白细胞介素-UIL-IP)等的生产和释放过程中起到了重要的作用MAPK也由此成为了研究最广泛的MAPKs信号通路。P38 MAPK在促炎性细胞因子如TNF-a和IL-ip的增量调节以及在转录和翻译水平上调控它们的合成和释放的信号转导网络中占据着核心位置从而被认为与许多慢性炎症和自身免疫性疾病的产生密切相关。近年来，研究发现p38 MAPK在疾病的发生发展过程中具有明显的调控作用，特别是在炎性反应性疾病的发生和发展中发挥了核心作用。因此，幵发和研究各种特异性、选择性的p38 MAPK抑制剂已经成为了治疗各类炎性疾病领域中的热点。
2数据来源及建模方法
2.1数据来源
近期，Laufer等人通过开发p38 MAPK ATP结合位点的疏水性口袋II (hydrophobicregion II/hydrophobic pocket II)，从而设计并合成了一批新的吡啶咪唑类化合物。这类化合物相比原来的SB203580吡啶咪唑类似物展示出了决定性的优势，不仅对p38MAPK具有更高的抑制活性值，而且展示了高选择性、低毒性以及优越的代谢性质等优点。研究表明，通过开发激酶不太保守的未被ATP占据的周边区域，有可能提高小分子抑制剂的药理学性能。因此，P38蛋白激酶上往往被忽视的暴露在激酶表面前端的区域最适合用来进一步改善小分子的活性和选择性。其中，疏水性口袋II属于p38 MAPK的一个不太保守的区域，不参与ATP的结合，而且不同激酶在这个区域的结构相差较大，这也就为设计和发现具有高活性和高选择性的新型p38 MAPK抑制剂提供了机会。因此，Laufer等人在4位吡啶基的邻位引入额外的大位阻正电性强（如氨基）的取代基，使新型抑制剂获得了更加稳定的代谢性质，减少了与CYP450系统的相互作用，并降低了体内毒性。此外，在咪唑核上引入不同的取代基，特别是咪哞核的N1位和C2位引入的取代基可以显著的改善抑制剂的理化性质，并降低毒性。在这里，这些新合成的2位硫代咪唑类抑制剂以及它们在体内的活性代谢转化产物（如砜和亚砜）相比原来的吡啶咪唑类似物展示了决定性的优势，比如与CYP450的相互作用更少以及更好的动力学和代谢性质等。因此，除去那些没有生物活性值或化学结构不明确的分子，本文从Laufer等人的文献中一共收集了 174个最新合成的具有广泛活性值的上述新型2-硫代咪唑类化合物作为研究对象。这些化合物在体外的生物活性值（即1(^值）被转化成相应的pIC5()值（-logIC5o)，并作为计算机模拟中的应变量。经过全面考虑化合物结构的多样性以及其生物活性值的大小，数据集中所有的分子按照大约4:1的比例分成训练集和测试集两个子集，其屮训练集用来建立模型，测试集则用来对所建立的模型进行外部测试。文献中，Laufer等人对这些2硫代咪唑类化合物共测定了两类活性的实验值，即p38cc的抑制活性(activity A,活性A)和TNF-a抑制活性（activity B,活性B)。本文对这两类活性都运用CADD技术进行了分析和研究。其中部分分子的TNF-a抑制活性的实验数据不全，因此除去没有TNF-cc抑制活性数据的分子，用于TNF-a模型建立的数据集为整个数据集中的151个2-硫代咪唑类化合物。
3P38a抑制活性的研究.........37
3.1数据及方法.........37
3.2定量构效关系研究（3D-QSAR) .........37
3.2.1CoMFA 和 CoMSIA 模型结果.........37
3.2.23D-QSAR模型的外部验证.........39
3.2.3疏水性参数ClogP的贡献.........41
3.2.4 3D-QSAR等势线图分析.........43
3.3分子对接结果分析.........47
3.4分子动力学模拟分.........50
3.5研究结果分析与讨论.........52
4TNF-a抑制活性的研究.........55
4.1数据及方法.........55
4.2定量构效关系研究（3D-QSAR).........55
4.2.1CoMFA 和 CoMSIA 模型结果.........55
4.2.23D-QSAR模型的外部验证.........57
4.2.33D-QSAR等势线图分析.........58
4.3药效团模型结果与分析.........63
4.4基于两类活性研究结果的分析.........66
结论
本课题借助计算机辅助药物设计的理论与方法，分别采用三维定量构效关系模型(3D-QSAR)、药效团模型、分子对接（Docking)和分子动力学（Molecular Dynamics,MD)模拟等计算模拟技术相结合的手段，首次对一系列新近合成的2-硫代咪唑类抑制剂进行了定量构效关系研究以及配体-受体相互作用机制的探讨。基于此类化合物对p38a (活性A)和TNF-a的抑制活性（活性B),分别建立了具有良好预测能力和较强可靠性的3D-QSAR模型，并考察了影响其活性的关键参数。通过对模型的分析得到了此类2-硫代咪唑类似物的结构特点，并揭示了其与p38MAPK受体的相互作用模式。这些结论都将有助于指导筛选和开发更优良的抗炎症疾病药物。本论文的研究结论及创新点如下所示：
1)基于两类活性分别建立了基于受体和配体的3D-QSAR模型，并展现了良好的预测能力以及较强的可靠性。其中基于活性A建立的CoMFA和CoMSIA模型的统计结果分别为：Q2=0.475, R2ncv=0.774, R2preK).668 以及 Q2=0.504, R2ncv=0.745, R2pre=0.709;基于活性B建立的CoMFA和CoMSIA模型的统计结果则分别为：Q2=0.561,R2ncv=0.810, R2pre=0.893 和 Q2=0.579，R2ncv=0.843, R2pre=0.926。
2)同时具有较强活性A和活性B的双料抑制的结构特点：R1位置，引入空间位阻中等大小的疏水性取代基有利于两类活性的提高；R2位置，被正电性的亲水性基团以及氢键供体取代都将有利；C环的6位，连接正电性的氢键供体有利；A环的1位，宜连接正电性的取代基；R3位置，宜连接位阻较小的负电性取代基或者氢键供体；A环的3位，宜连接氢键受体基团。
3)氢键效应和疏水性作用对两类活性的提高都发挥了关键性的作用。
4)对此类抑制剂进行药效基团搜寻得到了此类抑制剂分子作为TNF-a抑制剂必需的结构特征：两个疏水性中心，两个芳香环中心，两个氢键供体原子，两个氢键受体原子以及两个氢键受体点。
5)分析此类化合物与p38ot受体的相互作用机理，发现小分子主要通过四个氢键和两个强烈的疏水性作用（疏水性口袋I和II)与受体紧密结合。此外，本课题首次提出了具有此类骨架的抑制剂与p38ot受体结合的活性构象，即“龙虾”构象(the "lobster”active conformation)。
参考文献
[1]郑铭，张幼怡，韩启德.P肾上腺素受体的丝裂原活化蛋内激酶信号途径[J].生理科学进展’ 2002, 33(2): 111-114.
[2]朱忠，韩启德.G蛋內偶联受体激活丝裂原活化蛋白激酶的机理[J].生理科学进展，1998, 29(2): 141-144.
[3]范衡宁，佟超，孙靑原.丝裂原活化蛋内激酶(MAPK)信号通路的研究进展[J],动物学杂志，2002， 37(5)： 98-102.
[4]龚小卫，姜勇.丝裂原活化蛋白激》激活蛋白激酶（MK)研究进展[J].生物化学与生物物理进展，2007, 34(7) ： 695-701.
[5]蔡琪，李晓玫.丝裂原活化蛋A激酶信号转导通路研究进展[J].基础医学，1999,8(4):354-358.
[6]朱敏，孙振学.丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路[J].武警医学院予报，2006,15(5):500-503.
[7]马景德，齐秀芬.MAPKs信号通路及其与疾病关联性的研究现状[J].临床军医杂上，2004,32(2) ： 95-97.
[8]李小波，沈华浩.丝裂原活化蛋白激酶及其抑制剂与哮喘[J].国际时吸杂忑，2006’26(5)： 362-365.
[9]刘瑞，高维娟.丝裂原活化蛋内激酶信号通路及其在细胞凋亡中的作叫[J].中国名年宁杂志，2012, 32(18) ： 4089-4092.
[10]龚小，姜勇.丝裂原活化蛋A激酶(MAPK)生物嗲功能的结构基础[J].中国生物化学勾分+生物学报，2003, 19(1): 5-11.