HDAC克制剂丙戊酸对小动物淋巴细胞的药物结果和它作用机制钻研

一、前言

表观遗传学(Epigenetics)最初指关于基因及其表达产物影响表型形成的研究，现主要用来指DNA序列变化以外的可遗传的基因表达改变，这种影响基因转录活性而不涉及DNA序列改变的基因表达调控方式称为表观转录调控，其中包括DNA甲基化、组蛋白乙酞化、磷酸化修饰等[l]。在生命进程中体内基因的表达不仅取决于基因本身，还包括不改变基因序列的表观遗传修饰(Epigeneticmodification)，因此基因的表观调控参与到生命的各个进程中。
在肿瘤疾病的研究中我们发现，表观修饰对于肿瘤的诊断、发生发展和治疗具有重要意义。异常的表观修饰致使基因发生错误表达，进而引起代谢紊乱和疾病甚至恶J性肿瘤的发生，以往研究表明基因组甲基化水平持续降低，可致使原癌基因发生活化、转座子异常表达、基因组表达不稳定等，这些因素促进了肿瘤的发生;而且组蛋白过度的乙酞化，也是机体正常细胞恶变的诱因[2]。而且表观遗传修饰对于炎症反应及相关疾病的发生发展同样具有重要的意义，有研究表明，表观遗传对于免疫系统的影响主要通过表观修饰对Th细胞亚群的分化诱导，打破Thl和ThZ类细胞的平衡状态促使机体发生炎症病。机体在炎症反应进程中表观遗传的改变引起不同细胞因子的激活，导致细胞因子分泌水平发生改变，加剧炎症反应的程度。也有研究表明炎症发生时机体调节性T细胞FoxP3的表达量受到表观调节抑制，其转录抑制功能下调，这也是机体发生炎症反应的重要因素。
1.组蛋白去乙酞化酶及其抑制剂染色质结构调节作为真核细胞的基因表观调控的一个重要机制，包裹在染色质内部的核小体其高度有序DNA序列对于转录调控具有重要的意义。因此可以通过调节核小体组蛋白的乙酞化程度进而影响特定基因的转录水平。以往的研究表明调节组蛋白乙酞化状态的酶有两类，组蛋白乙酞化酶(HAT)和组蛋白去乙酞化酶(HDAC)。在真核生物体内HAT可以把乙酞辅酶A的乙酞基转移到组蛋白末段特定部位的赖氨酸残基上，利用其所带的负电荷中和赖氨酸上的正电荷，从而降低DNA与组蛋白的亲和力，舒展核小体的结构，促进启动子结合，激活基因的转录。另一方面，HDAC去除乙酞基团，恢复初始正电状态，染色质被压缩成更为致密的结构，抑制其转录活性。进一步研究发现，乙酞化修饰除了调节组蛋白的功能也可以调节多种非组蛋白的表达和功能，这些非组蛋白包括基本和序列特异性转录因子、细胞周期相关蛋白、转录关键信号分子。

2、视网膜母细胞瘤蛋白等[6]。因此，HDAc可通过调节乙酞化和去乙酞化的平衡状态参与到基因的表观遗传的调节中。组蛋白去乙酞化酶抑制剂(Histonedeaeetylasesinhibitors，HnAels)是近年来发现的一类新的靶向抗肿瘤药物，HDACI能够抑制HDAC的活性，引起组蛋白乙酞化程度升高，改变核小体原有带电情况，促使染色质结构发生致密卷曲，从而促进相关基因转录，在肿瘤细胞中则表现为细胞形态和功能的改变，引起肿瘤细胞增殖抑制、诱导凋亡及促进分化等一系列结果，从而达到治疗肿瘤的目的。一般认为体内HDAc过度表达，基因表达平衡状态出现失衡，极易引起细胞增殖，活化以及细胞周期的相关分子表达紊乱，进而发生细胞恶变。因此，HDAclS成为目前肿瘤化疗药物研究领域的热点之一[9]。
近年来研究发现HDACIs除了明确的抗肿瘤活性外，HDACIs还具有免疫调节活性，研究表明HDACIs通过抑制细胞因子如TNF一a，IL一6以及一氧化氮的合成参与到多种炎症反应中，体外研究表明HDACIs一TSA对激活的细胞表面标志CD4的表达具有明显的抑制作用，然而对未激活的T细胞表面分子CD4表达则无影响，这说明HDACIS可抑制T淋巴细胞的表面标志的表达，对初始T细胞具有免疫抑制作用。而且除了淋巴细胞外，HDAcIS对Dcs也有作用，HDACIS可以抑制表面分子CD14表达以及其共刺激分子CD80和活化标志物cD83的表达，对DcS免疫功能具有抑制作用。同时对于调节性T细胞，HDAcls也可通过促进其标志物FOXP3的表达，进而引起调节性T细胞产生增加，参与到多种炎症反应中，如小鼠系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎，以及移植物抗宿主病等免疫系统疾病[4]，因此HDAcIS是一种潜在的免疫调节剂其免疫调节机制有待进一步探索。

目录
二、实验材料与设备................................12
l实验动物............................................12
2主要试剂................................................12
3主要仪器.............................13
三、实验方法和步骤 .......................................10
1.小鼠淋巴细胞悬液的制备..................................16
2.ZVPA对小鼠T淋巴细胞早期活化的影响.......................16
3.CFDA一SE染色法检测VPA对小鼠T淋巴.......................16

讨论
HDAC克制剂丙戊酸对小动物淋巴细胞的药物结果和它作用机制钻研,T淋巴细胞是免疫系统中重要的免疫活性细胞，T细胞的活化和增殖是其执行免疫功能的基础，也是免疫调控的中心环节。T淋巴细胞的过度活化和增殖，可导致自身免疫病和器官移植排斥反应的发生，然而T淋巴细胞的持续不应答，则可引起免疫缺陷和易感疾病的发生。因此，研究可调节T淋巴细胞活化和增殖的药物在有效地控制机体的免疫应答方面具有积极作用。我们分别采用了小鼠体外T淋巴细胞活化、增殖、周期、凋亡和细胞因子表达模型，从细胞和分子水平系统分析了V队对免疫系统调节方面的影响。
结果发现，VRA可显著抑制多克隆刺激剂(Co叭或PDB月on)诱导下的T淋巴细胞的增殖和细胞因子的表达并呈现剂量依赖效应，而对于淋巴细胞的活化和凋亡具有双向调节效应。对于体外诱导淋巴细胞的活化有多种途径，其中PKC激活剂和钙离子导入剂联合使用，可模拟磷酸肌醇酷水解所产生的两个第二信使分子DAG和IP3，激活PKC，并使细胞内钙离子的水平升高，从而绕过信息跨膜传递相关的蛋白，二者协同作用诱发IL一2和IFN一y等细胞因子基因的活化和表达[40]，而conA通过与T细胞表面cD3汀cR复合体结合，将导致包括eD3、eD4、CDs以及淋巴细胞活化因子(leukocyte一activatingfaetor，LAF一l)在内的系列细胞表面分子磷酸化，之后通过激活蛋白激酶c(Proteinkinasec，PKCe)和胞内钙离子通道引起细胞活化增殖。两种刺激剂的共通之处在于，经由不同的途径最终都引起胞内钙离子通道打开和PKC激酶的激活。在本研究中，我们利用这些多克隆刺激剂，在体外培养系统中研究HDAC抑制剂VPA的免疫调节作用及机制。
文献报道显示，对于PDB联合离子霉素诱导的淋巴细胞表达IL一2的CD4+T细胞的百分率高于cDS+T细胞，而表达IFN一丫的T细胞的比率则恰相反[56〕，本实验的结果与这些报道一致，表明IL一2主要是由CD4+T细胞所分泌，而IF主要是由CDS+T细胞所表达。而且我们发现，VPA在口服可达到的体内浓度(l~ol几)时己经能够显著降低CD4十和CDS+T细胞表达IL一2和IFN一Y;当VPA浓度升高后，其抑制作用更强。值得注意的是，VpA对IL一2+IFN一犷双阳性的T细胞也有明显抑制作用。研究表明，同时表达IL一2和IFN一丫的cD4十和cDS+T细胞，是处于分化早期的细胞，相当于中央型记忆细胞，而单独表达其中一种细胞因子的细胞则处于分化的后期，相当于效应型记忆细胞。队对处于不同分化阶段的T细胞表达细胞因子的能力均有明显抑制作用。

参考文献
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