引言
尿酸（Uric acid，UA）是人类身体中嘌呤类代谢终产物。人体内尿酸主要有两个来源：内源性尿酸，由体内核酸分解代谢产生，大约占体内总尿酸的 80％；外源性尿酸，由富含嘌呤食物的核苷酸分解产生，大约占人类体内尿酸的 20％。尿酸在人体内的排泄途径主要有 2 条：约 70%的尿酸经肾脏排泄，经过肾小管的重吸收、分泌和再吸收，约 10％的尿酸最后随尿液排出；约 30%的尿酸经胃肠道和胆道排泄。尿酸生成过多或排泄减少，均可导致血尿酸升高，最终导致高尿酸血症。相比其它类哺乳动物，人类在进化过程中受基因突变和环境的影响，失去了编码尿酸酶的功能基因，使人类血尿酸浓度远远高于其他哺乳类[1]。而其他哺乳动物血尿酸水平很低，因为其普遍存在尿酸酶，可使尿酸最终分解成水溶性的尿囊素（allantoin），随尿液排出[2]。
高尿酸血症（Hyperuricemia，HUA）通常定义为血清中尿酸（Serum uric acid，SUA）水平男＞7mg/dl，女＞6mg/dl。HUA 的发病率因环境、区域、饮食风俗不同差异很大，沿海地区和经济发达地区人群由于高嘌呤食物摄入较多，血尿酸水平和高尿酸血症发病率较内陆地区高[3]。近些年来，随着人民生活水平的提高和饮食结构生活方式的改变，高尿酸血症的发病率逐年升高。据报道上个世纪 70 年代美国男性平均 SUA 水平由 20 年代小于 3.5mg/dl 升至 6.0-6.5mg/dl，女性血尿酸也上升0.5-1.0mg/dl，上涨水平低于男性，可能是由于雌激素具有促进尿酸排泄的功能[4]。尿酸在血浆中的溶解度很低，极易形成饱和而产生尿酸盐结晶（Monosodium urate，MSU），沉积在关节和肾脏，诱发痛风（Gout）和尿酸肾结石。痛风是一种结晶沉积性疾病，尿酸在人体组织中过饱和时，尿酸盐晶体沉积在关节附近，产生炎症反应。痛风是男性最常见的炎症性关节炎，严重影响生活质量[5]。
近年来，大量的前瞻性流行病学调查研究表明，高尿酸血症是痛风性关节炎的重要原因，并与许多心血管疾病相关，如高血压，糖尿病，代谢综合征，动脉硬化，脑血管病，肾血管疾病等。然而，由于 HUA 伴随的危险因素常与这些疾病的危险因素同时存在，如肥胖、高血压、胰岛素抵抗等，当校正这些危险因素后，部分研究结果表明，高尿酸并不是糖尿病及其他心血管疾病的独立危险因子[6,7]。自 1951年 Gertler[8]第一次将尿酸描述为冠状动脉粥样硬化心脏病可能的危险因素后，60 多年来，SUA 与心脑血管疾病的关联仍一直在争议不断。最近 A.E Berezin 等人研究发现，血清尿酸是冠状动脉钙化的一个独立危险因素[9]。Lv 的 meta 分析结果显示尽管校正了其它多个代谢综合征成分，SUA 与Ⅱ型糖尿病仍独立相关[10]。对 SUA与心血管疾病发生风险评估最具影响力的 4 项大规模前瞻性临床调查均显示 SUA水平是脑卒中、急性心肌梗死和所有心血管事件的独立危险因素[11-14]。越来越多的证据显示，血尿酸水平成为多种心血管疾病的独立危险因素。
动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）为冠心病的病理学基础，与多类心血管事件相关。近年来高尿酸血症与 AS 的关系成了研究热点[15]。Krishnan 的前瞻性调查发现，HUA 是亚临床动脉粥样硬化的独立的危险因素，研究采用 CT 检测冠状动脉钙化评估亚临床 AS[16]。Kuo 的一项横断面研究，在较正了其他危险因素后发现，HUA 与 AS 及心脏肥厚相关[17]。子。颈动脉被认为是反应全身动脉硬化的窗口，颈动脉粥样硬化时，颈动脉中膜厚度（Carotid intima-media thickness，CIMT）增厚改变早于斑块发生。多项研究在较正了其他危险因素后，发现 HUA 与颈动脉中膜厚度相关[18-20]。尿酸与动脉粥样硬化相关的机制目前尚不清楚，目前认为可能与以下几种因素有关。（1）尿酸与血管内皮细胞：可溶性尿酸会直接杀伤血管内皮细胞。有实验证实，在动脉硬化斑块里发现了更高浓度的尿酸，证明尿酸在动脉硬化发生中产生了直接作用[15]。尿酸损伤血管内皮细胞的详细机制目前还不清楚。有观点认为，高尿酸导致血管内皮损伤的一个重要原因是嘌呤氧化酶（Xanthine oxidase，XO）所导致的氧化应激；另外，HUA 时循环血小板活化也会导致内皮功能障碍。（2）尿酸与血管平滑肌细胞。平滑肌细胞的增殖和迁移是动脉粥样硬化的形成和发展的一个重要组成部分。研究表明 UA 能够促进 VSMC 增殖[21]。
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第一部分 尿酸诱导大鼠原代平滑肌细胞向成骨样细胞分化
前言
血管平滑肌细胞（VSMC）在血管中膜，是一种多潜能细胞。在人体的发育过程当中，VSMC 通常会表现出两种表型，合成型与收缩型。合成型多出现在胚胎期或正在发育的组织器官，可以在多种生长因子的作用下进行细胞分裂、增殖、分化，在血管壁的生成和损伤修复中发挥重要作用。收缩型平滑肌细胞为终末分化的细胞，但在某些理由因素及细胞因子的诱导下，VSMC 可以由收缩型表型向合成型表型转化，进行分裂、增殖和成骨样细胞分化[1]。血管壁损伤及动脉粥样硬化时，均可见 VSMC 由收缩型表型向合成型表型转化，并成骨样细胞分化。目前的研究认为，血管平滑肌细胞是介导血管钙化过程当中的主要细胞[2]。尿酸作为人体嘌呤代谢的产物。有研究证实尿酸通过血管肾素-血管紧张素系统刺激 VSMC 增殖[3]。也有文章报道尿酸可以诱导人体骨髓间充质干细胞向成骨样细胞及向神经细胞分化[4-6]。本部分我们探讨尿酸是否可以诱导大鼠原代胸主动脉平滑肌细胞向成骨样细胞分化。
碱性磷酸酶（ALP）是细胞向成骨细胞分化早期的标志性酶之一，其活性高低在一定程度上可以反应细胞成骨样分化能力的高低，已被普遍认为是细胞成骨分化的标志[7]。骨形态发生蛋白是转化生长因子-β超家族成员，在该家族中，BMP-2 和BMP-7 被认为是血管钙化的最密切相关的两个成员。BMP-2 在动脉粥样硬化斑块和钙化纤维帽中可见表达，但没有在没有损坏的动脉组织中表达[8]。氧化应激、炎症、高脂、高糖等均能触发 BMP-2 在血管组织的表达，BMP-2 通过不同的效应基因参与动脉钙化过程。骨桥蛋白（Osteopontin，OPN）是血管平滑肌细胞由收缩表型向合成表型转化的标志基因。OPN 可以促进平滑肌细胞增殖与迁移，使动脉中膜大量聚集平滑肌细胞生长，且分泌更多的炎性介质，促进血管钙化[9]。Runt 相关转录因子 2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）是调节细胞向成骨样细胞转化过程当中的特异性的转录因子，也是成骨分化早期重要的调控基因之一。Runx2 表达上调可促进成骨分化[10]。
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材料与方法
1 材料与仪器
1.1 主要实验仪器和耗材
超净工作台： 中国东联哈尔仪器有限公司
二氧化碳细胞孵育箱： 美国 Thermo 公司
倒置相差显微镜： 日本尼康公司
倒置荧光显微镜： 日本尼康公司
低速自动平衡离心机： 中国长沙湘仪离心机仪器有限公司
台式离心机（TG165）： 中国长沙平凡仪器有限公司
电热恒温浴箱： 中国上海精宏实验设备公司
4℃ 低温冰箱： 中国 Haier 公司
-20℃ 低温冰箱： 中国 Haier 公司
-80℃ 低温冰箱： 美国 Thermo 公司
液氮罐： 美国 Thermo 公司
程序降温盒： 美国 Thermo 公司
电子分析天平： 中国赛多利斯科学仪器公司
超纯水机： 美国 Millipore 公司
PH 计： 中国上海精密科学仪器有限公司
1.2 实验动物
清洁级 6-8 周健康雄性 Sprague-Dawley（SD）大鼠（200-250g）购自山东鲁抗实验动物中心。
1.3 实验试剂
酚红 DMEM 培养液： 美国 Hyclone 公司
胎牛血清（FBS）： 美国 Hyclone 公司
二甲基亚砜（DMSO）： 美国 Hyclone 公司
0.25％胰酶（含 0.02%EDTA）： 美国 Hyclone 公司
尿酸： 美国 Sigma 公司
青霉素-链霉素双抗： 中国北京 Solarbio 公司
磷酸盐缓冲液（PBS）： 中国北京 Solarbio 公司
CCK-8 试剂盒： 广州亦源生物科技有限公司
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第三部分 尿酸通过激活 Wnt/β-catenin 通路促进血管平滑肌细胞向成骨样细胞分化.....69
前言..................................................................69
材料与方法..........................................................71
结果.................................................................84
讨论................................................................88
参考文献..........................................................91
全文结论.........................................................94
第三部分 尿酸通过激活 Wnt/β-catenin 通路促进血管平滑肌细胞向成骨样细胞分化
讨论
细胞成骨受许多种因素的调控，而在多种因素中，细胞的信号通路起到了关键作用。目前比较经典且研究较多的几条信号通路是转化生长因子-β及其诱导的BMPs/Smad（TGF-β/BMPs/Smad）信号通路，Wnt/β-连环蛋白（Wnt/β-catenin）信号通路和 MAPK 信号通路。TGF-β/BMPs/Smad 信号通路参与细胞增殖、细胞基质形成和细胞分化等多种生物过程[7]。Smads 为 TGF-β/BMP 在细胞里的信号传导最为关键的下游转导介质，TGF-β与受体结合以后，其 II 型受体使 I 型受体发生磷酸化，继而磷酸化与 TGF-β产生特异性反应的 Smads 蛋白，致使细胞内信号传导被激活[12]。研究报道，铈能通过 TGF-β/BMPs/Smad 信号通路上调 Runx2 mRNA 水平表达，诱导 MSC 向成骨样细胞转化[13]。多项研究证实外界因素通过刺激 TGF-β/BMPs/Smad 通路而增加 ALP的表达，从而诱导细胞成骨样细胞转化[14,15]。
Wnt/β-catenin 通路是经典的 Wnt 通路，而β-catenin 为 Wnt/β-catenin 通路的关键因子，其在细胞增殖以及细胞成骨样细胞分化的过程当中发挥着重要作用。Wnt蛋白与细胞表面受体 FZD 蛋白及 LRP 结合。这些复合蛋白及胞内一系列相关因子的相互作用，抑制了 GSK-3β对β-catenin 的磷酸化作用，使胞浆中β-catenin 增多。β-catenin 进入核内，与 TCF/LEF 结合形成复合物，启动下游目的基因的转录[7]。最近的多项研究证实，激活 Wnt/β-catenin 信号通路可促进非成骨细胞表达成骨细胞表型标志物，提示可促进细胞成骨样细胞分化[16-18]。TGF-β/BMPs/Smad 通路和Wnt/β-catenin 通路不仅可以调节细胞成骨，还可以在通路激活及生物学效应的不同阶段进行相互调节[19]。
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全文结论
大量的临床调查及循证医学实践证实 HUA 是心脑血管系统疾病独立的危险因素。血管钙化可导致血管脆性及僵硬度增加，增添了动脉斑块、血管破裂及动脉瘤形成的危险性，是导致心肌梗塞、中风等心脑血管事件的重要危险因子。高尿酸是否通过诱导血管钙化参与动脉硬化的发生和发展，从而诱发各种心血管疾病值得探讨。血管钙化与血管壁细胞，尤其是血管的平滑肌细胞在各类刺激因素作用下活化，转化成为成骨样细胞密切相关。大量研究证实尿酸可诱导血管平滑肌细胞增殖及氧化应激。高尿酸是否通过诱导血管平滑肌细胞转化为成骨样细胞导致血管钙化目前尚不清楚，对其进行深入研究，势在必行。前期工作中，课题组在国际上首次在动物模型中发现高尿酸血症导致以早期出现弥漫性血管钙化为特征的动脉硬化的直接证据。基于该发现，本课题通过体外不同浓度尿酸刺激大鼠原代平滑肌细胞，对其成骨样细胞转化指标进行了检测，并探讨了其机制，得出如下结论。
本研究存在一定的局限性，在机制的探讨方面，还应该用不同种方法验证其机制。
下一步研究计划：基于以上发现，课题组下一步拟将成骨诱导剂改为高磷，探讨高尿酸在高磷环境下对血管平滑肌细胞成骨样细胞转化的影响。机制探讨方面选择 TGF-β/BMPs/Smad 信号通路，探讨 TGF-β/BMPs/Smad 信号通路在高尿酸诱导VSMC 成骨样细胞转化的作用。
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参考文献（略）